[发明专利]确定突变核酸碱基的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种确定样本中靶核酸序列的鉴定区域是否存在突变核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤a：提供能够扩增产物的一对引物：第一引物和第二引物，扩增所述靶核酸序列包括所述鉴定区域的一段核酸序列得到扩增产物，其中所述第一引物可杂交于所述靶核酸序列的所述鉴定区域，所述鉴定区域含有突变核苷酸，所述第一引物序列和相对应的所述靶核酸序列分为至少三个部分：5'端互补部分，不互补部分，3'端互补部分，其中所述3'端互补部分含有至少两个核苷酸，并且与所述包括突变核苷酸的鉴定区域互补；

提供标记的寡核苷酸探针，所述标记的寡核苷酸探针包含一个可检测的基团和拥有一段基于所述靶核酸序列的扩增区域的序列；

步骤b：利用核酸聚合酶对反应混合液通过PCR实施扩增反应，所述扩增反应的反应混合液包含所述核酸聚合酶、所述标记的寡核苷酸探针和所述一对引物；

步骤c：通过扩增曲线确定扩增产物，如果所述靶核酸序列含有突变核苷酸，所述第一引物与所述含有突变核苷酸的靶核酸序列的所述鉴定区域杂交，由于所述3'端互补部分完全互补，使得所述第一引物延伸，产生扩增反应；如果所述靶核酸序列不含有突变核苷酸，所述第一引物与正常靶核酸序列杂交，由于所述3'端互补部分不完全互补，使得所述第一引物不能延伸，不能产生扩增反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一引物的所述3'端互补部分的3'末端核苷酸与所述靶核酸序列的所述突变核苷酸互补。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一引物的所述3'端互补部分的3'末端第二个核苷酸与所述靶核酸序列的所述突变核苷酸互补。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一引物的所述3'端互补部分含有两个核苷酸，并且与所述包括突变核苷酸的靶核酸序列的所述鉴定区域互补。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一引物的所述3'端互补部分含有三个核苷酸，并且与所述包括突变核苷酸的靶核酸序列的所述鉴定区域互补。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目多于所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目，从而所述不互补部分在所述第一引物上形成一个凸起。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目是1或2或3，所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目是0。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目是2或3或4，所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目是1。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目少于所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目，从而所述不互补部分在所述靶核酸序列上形成一个凸起。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目是0，所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目是1或2或3。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目是1，所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目是2或3或4。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目与所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目相当，所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目是2或3或4，所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目是2或3或4。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标记的寡核苷酸探针包含一个报告标记和一个淬灭标记，其中所述淬灭标记在当所述标记的寡核苷酸探针是单链结构且没有与所述靶核酸序列杂交时，能够淬灭所述报告标记的荧光；其中所述标记的寡核酸探针与所述靶核酸序列杂交形成双链结构后，所述报告标记的荧光不能被淬灭，此时所述报告标记的荧光强度比当所述标记的寡核苷酸探针是单链结构且没有与所述靶核酸序列杂交时的荧光强度更强。