[发明专利]确定突变核酸碱基的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及核酸扩增技术领域，尤其涉及了一种确定样本中靶核酸序列的鉴定区域是否存在突变核苷酸的方法及试剂盒。

背景技术

单核苷酸多态性(SNPs)是人类基因组中最常见的突变类型。点突变通常也是SNPs，但是这个术语通常指那些低频率发生或者是已知功能，可导致疾病的突变类型(GibsonNJ,2006,ClinChimActa.363(1-2):32-47)。虽然有多种方法，但是还没有一种被广泛接受的简便方法。许多确定基因组DNA低频突变的方法是利用聚合酶链反应(PCR)来扩增突变型和野生型靶序列，PCR产物可用多种方法进行分析，包括测序、寡核苷酸连接、限制性酶切、质谱或者等位基因特异的寡核苷酸杂交等方法均可实现从大量野生型背景基因中鉴定突变型。其它的方法利用等位基因特异性PCR选择性扩增低频率突变的靶核酸序列，利用或者是不利用附加选择。

这些确定稀有突变的PCR方法存在的共同问题是扩增反应时复制并不完全可靠，探针杂交时也会有错误配对情况出现。Newton(NucleicAcidsRes.17:2503-16,1989；U.S.Pat.No.5,595,890)等描述的常规突变检测方法显然都存在这些缺陷。所述的扩增阻碍突变系统(ARMS)利用等位基因特异性突变引物进行PCR反应。该方法利用引物的3'端与突变子的特异序列互补，由此引物得以延伸，而野生型序列因3'端不匹配而不能被延伸。这种方法要求每种突变都有相对应的特异性引物，同时PCR反应需要非常严格的反应条件。扩增中的错配常导致复制不精确或复制错误。

最近，利用PNA(或LNA)钳技术的PCR富集和测定方法已经发展起来了(B.Tabacketal.,2004；A.Senescauetal.,2005；XDavidRenetal.,2009；ToddS.Laughlinetal.,2008；K.Udagawaetal.,2005；HitoshiMiyazawa,etal.,2008)。高亲和力的核酸类似物如肽核酸(PNAs)被用于抑制核酸扩增(U.S.Pat.No.5,891,625和D.B.Demersetal.,1995,H.Orumetal.,1993)。PNA(LNA)-DNA双链体比DNA-DNA双链体更加稳定。因此，PNA(或LNA)能够特异地阻止在一个完全匹配的模板上的引物退火或延伸过程。

美国专利号7,803,543公开了一种检测核酸样本中是否存在靶序列上核苷酸变异的方法，检测步骤包括引物对的应用，PCR扩增这对引物形成的产物包含该靶序列，而肽核酸(PNA)就像一个PCR钳，起到感应探针的作用。该方法使用的第一个引物距离靶序列的5'端至少有30个或更多的核苷酸。PCR过程要求延伸反应的温度低于完全匹配的探针的熔解温度。这个方法也有很多缺点，标记的PNA探针合成比较困难，价格比较昂贵。这个方法要求有个高Tm值的锚定探针，使得反应和设计变得复杂。如果样本只含有正常的靶核酸，PNA能够使反应停止，因此必须设立单独的质控品来测试反应体系是否有效。这种方法重复性和灵敏性低。

美国专利申请公开号2004/0014105A1公开了在一个样本中选择性的富集低丰度多聚核苷酸的方法。这种方法利用酶催化的不能延伸的寡聚核苷酸选择性的阻滞高丰度核酸的聚合酶活性，因此导致低丰度核酸的富集。

美国专利申请公开号2004/0091905A1公开了一种在突变多聚核苷酸、野生型多聚核苷酸和不相关多聚核苷酸的混合物中检测突变多聚核苷酸的方法。这种方法利用一种延伸引物，它在野生型和突变型多聚核苷酸中都能与第一靶序列互补。还利用一条探针，这条探针只能与野生型多聚核苷酸的第二靶序列互补，不能与突变型互补。引物与第一靶序列的退火延伸使突变型多聚核苷酸产生长的产物。在野生型多聚核苷酸中引物与第一靶序列退火后的延伸被探针与第二靶序列的退火所抑制，因而只产生短的延伸产物或者是没有产物。分离产物后再做PCR，PCR优先的扩增长的产物。