[发明专利]一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

1)培养副溶血弧菌菌种并提取DNA；

2)设计副溶血弧菌外膜蛋白编码序列的引物对，以副溶血弧菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增；

3)PCR产物和载体pET-28a(+)分别进行双酶切、连接后转化到E.coli DH5α感受态细胞，已含卡那霉素平板进行突变筛选阳性克隆，并对筛选得到的阳性克隆进行PCR、双酶切鉴定及测序分析，以验证成功获得溶血弧菌外膜蛋白lptD基因的重组载体；

4)将重组载体pET-28a(+)-lptD转化至E.coli BL21感受态细胞中，挑取单克隆摇菌过夜；

5)转接种子液，并在37℃，200r/min下培养至OD600约为0.4后，添加终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养3～4h，以诱导溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白表达；

6)溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白的纯化。

2.根据权利要求1所述的一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法，其特征在于：所述的引物对的核苷酸序列为：上游引物：5’-CGCCATATGATGCAACATTTCTCC-3’；下游引物：5’-CCGCTCGAGTTAATTGTTCAAATAG-3’。

3.根据权利要求1所述的一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)中所述的PCR反应体系均为：10×Taq DNA聚合酶缓冲液5μl，10mM dNTPs1μl，上游引物和下游引物各1μl，Taq DNA聚合物1μl，模板DNA2μl，超纯水38μl，PCR反应体系共50μl。

4.利要求1所述的一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD作为疫苗组分的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的疫苗用于抵抗细菌感染。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的细菌为副溶血弧菌。

7.根据权利要求1所述的一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD在制备抗细菌感染制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的细菌为副溶血弧菌。