[发明专利]一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法及其免疫保护功能的应用。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海水养殖动物的主要病原菌，每年由该菌引起的弧菌病给养殖业造成严重损失，同时副溶血弧菌也是食源性病原菌，对该菌的研究已引起全世界的关注。目前对该菌的预防和治疗主要是依靠抗生素，但因长期大量使用，已引起抗药性，且引起抗生素在动物体内的富集，对人类健康造成危害。近年来的研究表明暴露于副溶血弧菌外表面的外膜蛋白具有一定的免疫原性及抗原性。因此，依赖于外膜蛋白的来研制相应的疫苗来防治细菌性疾病是一种安全有效的方法，与其它防治途径相比，以疫苗为主的免疫防治有不可替代的优势。因而利用筛选具高效保护性外膜蛋白，研制亚单位疫苗具有广阔的市场前景。

外膜蛋白(outer membrane proteins,OMPs)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，约占外膜结构的50％。外膜蛋白直接与外环境接触，在维持外膜结构、物质运输、细胞表面识别和信号转导等方面起重要作用，而且某些外膜蛋白可促进细菌粘附和定植、干扰或逃避宿主的免疫防御作用，是病原菌感染以及致病的关键因素之一。近年来的研究已证实某些外膜蛋白具有良好的免疫原性，可促进宿主产生免疫防御反应，是极具发展前景的疫苗靶位。

脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)也称为内毒素，也是革兰氏阴性细菌外膜的主要组分之一，它对于绝大多数革兰氏阴性菌有着至关重要的作用。脂多糖不仅能为这些细菌提供保护，帮助它们抵御恶劣的环境和外界的毒素(包括抗生素)，也是导致炎症和人体天然免疫反应的主要原因，在人体免疫系统对抗细菌入侵时，LPS作为重要的抗原分子被抗原递呈细胞捕获，从而引起机体的免疫反应。目前，脂多糖在细菌胞质中的合成已经有了很深入的了解，但直到近年才发现脂多糖的跨膜转运以及在外膜上的组装由LptA-G蛋白质复合物负责完成。而定位于外膜上的跨膜蛋白LptD(LPS-assembly protein,LPS转运和装配蛋白)通过与外膜脂蛋白LptE相互作用转运脂多糖跨过细菌外膜并组装形成细菌外膜的外小叶。LptD-LptE膜蛋白复合体被认为是革兰氏阴性细菌存活的“命门”。因而LptD对细菌的生理功能和毒力具有关键作用。

发明内容

本发明旨在提供一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法及其免疫保护功能的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法，包含以下步骤：

1)培养副溶血弧菌菌种并提取DNA；

2)设计副溶血弧菌外膜蛋白编码序列的引物对，以副溶血弧菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增；

3)PCR产物和载体pET-28a(+)分别进行双酶切、连接后转化到E.coli DH5α感受态细胞，已含卡那霉素平板进行突变筛选阳性克隆，并对筛选得到的阳性克隆进行PCR、双酶切鉴定及测序分析，以验证成功获得溶血弧菌外膜蛋白LptD基因的重组载体；

4)将重组载体pET-28a(+)-lptD转化至E.coli BL21感受态细胞中；

5)挑取单克隆摇菌过夜，转接种子液，并在37℃，200r/min下培养至OD600约为0.4后，添加终浓度为1mM的IPTG，继续培养3-4h，以诱导溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白表达；

6)溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白的纯化。

本发明所述引物对的核苷酸序列为：

上游引物：5’-CGCCATATGATGCAACATTTCTCC-3’；

下游引物：5’-CCGCTCGAGTTAATTGTTCAAATAG-3’。

步骤(2)和步骤(3)中所述的PCR反应体系均为：10×Taq DNA聚合酶缓冲液5μl，10mM dNTPs1μl，上游引物和下游引物各1μl，Taq DNA聚合物1μl，模板DNA2μl，超纯水38μl，PCR反应体系共50μl。