[发明专利]一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成莱鲍迪苷A中的应用

权利要求书

1.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述重组毕赤酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体线性化后转化毕赤酵母而获得：

编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列如SEQ ID NO. 3所示，

编码UDP-糖基转移酶UGT76G1的DNA序列如SEQ ID NO. 4所示;

所述表达载体包括胞内表达载体和表面展示表达载体，所述胞内表达载体是将如SEQ ID NO. 3所示的DNA序列克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA而获得胞内表达载体pPICZA-Sus1；所述表面展示表达载体是将如SEQ ID NO. 4所示的DNA序列与锚定蛋白Gcw61编码基因融合后克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表面展示表达载体pGCW61- UGT76G1。

2.一种重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、编码基因的获取：以蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的氨基酸序列为基础，对序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的对应编码序列；其中，蔗糖合成酶Sus1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码序列如SEQ ID NO. 3所示；UDP-糖基转移酶UGT76G1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码序列如SEQ ID NO. 4所示；

步骤二、表达载体的构建：将步骤一获取的编码基因分别接入毕赤酵母的表达载体中，所述表达载体包括胞内表达载体和表面展示表达载体，所述胞内表达载体克隆有编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列，所述表面展示表达载体克隆有编码UDP-糖基转移酶UGT76G1的DNA序列；所述胞内表达载体是将如SEQ ID NO. 3所示的DNA序列克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA而获得胞内表达载体pPICZA-Sus1；所述表面展示表达载体是将如SEQ ID NO. 4所示的DNA序列与锚定蛋白Gcw61编码基因融合后克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表面展示表达载体pGCW61- UGT76G1;

步骤三、表达载体转化及重组毕赤酵母工程菌获取：将表面展示表达载体经酶切线性化并纯化后电转化至感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，从而得到初级重组毕赤酵母工程菌，再将胞内表达载体经酶切线性化并纯化后电转化初级重组毕赤酵母工程菌的感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌；或者，将胞内表达载体经酶切线性化并纯化后电转化至感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，从而得到初级重组毕赤酵母工程菌；再将表面展示表达载体经酶切线性化并纯化后电转化初级重组毕赤酵母工程菌的感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌。

3.如权利要求2所述的重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：将表面展示表达载体pGCW61-UGT76G1经Kpn2 I单酶切线性化并纯化后电转化Pichia pastoris GS115感受态细胞，并在MD平板上筛选阳性转化子，从而得到工程菌GS115/ UGT76G1；再将胞内表达载体pPICZA-Sus1经Pme I单酶切线性化并纯化后电转化上述GS115/ UGT76G1感受态细胞，并在博来霉素抗性平板上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌GS115/ Sus1- UGT76G1。

4.一种全细胞催化剂，其特征在于：包含如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌。

5.如权利要求4所述的全细胞催化剂，其特征在于，所述全细胞催化剂是通过如下步骤制备而成：

（1）挑取上述重组毕赤酵母工程菌接种至BMGY培养基进行初级培养至OD600接近5.0-6.0，离心收集细胞；

（2）然后将收集的细胞重悬到BMMY 培养基至起始OD600接近0.5-1.0，于25-35℃条件下进行次级培养，次级培养过程中每天补加终浓度1%甲醇，发酵3天后在离心回收菌体；

（3）菌体冻干后即得到含重组毕赤酵母工程菌的全细胞催化剂。

6.一种莱鲍迪苷A的合成方法，其特征在于：该方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷为原料，以权利要求4或5中所述的全细胞催化剂为催化剂合成莱鲍迪苷A。

7.如权利要求6所述的莱鲍迪苷A的合成方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）按如下组分及其浓度制备反应体系；

50mM PBS缓冲液，

3mM MgCl2，

250 mM 蔗糖，

0.5-1mM UDP，

3mg/mL甜菊苷；

（2）向反应体系中加入菌体量为30OD含有重组毕赤酵母工程菌的全细胞催化剂，于37℃进行反应12h后终止反应；

（3）每200ul反应液用600ul正丁醇萃取反应体系中的莱鲍迪苷A，吸取上层正丁醇萃取液而后进行纯化分离得到莱鲍迪苷A。