[发明专利]一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成莱鲍迪苷A中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成莱鲍迪苷A中的应用。

背景技术

甜菊糖（Steviol glycoside）是一种具有很多优良特性的高甜度天然甜味剂，在食品、饮料、酿酒、医药、日用化工等领域均有着巨大的应用价值。甜菊糖带有后苦味和甘草异味，混合物组分复杂，难以对其质量规格进行统一，限制其应用。甜菊苷（Stevioside）和莱鲍迪苷A（Rebaudioside A）是甜菊糖中含量最丰富的两种成分，分别占干叶重的5-10%和2-4%。莱鲍迪苷A (RA) 是一种无毒、安全、低热能、高甜度的天然甜昧剂，其甜度是蔗糖的150-300 倍，热值仅为蔗糖的1 /300，而且口味纯正，没有后苦味；因而具有巨大的应用价值。目前制备高纯度莱鲍迪苷A产品的方法有：培育高产莱鲍迪苷A的甜叶菊品种、树脂吸附或重结晶提纯莱鲍迪苷A、环糊精转移酶等酶对甜菊糖进行改性，但都存在工艺繁琐、成本高、效果不佳等缺点。那么，是否能够从莱鲍迪苷A (RA)的生物合成途径入手，结合基因工程技术、构建一种以相应底物为基础，通过发酵高效合成莱鲍迪苷A (RA)的工程菌，并将其运用于莱鲍迪苷A (RA)的合成加工领域，以提高莱鲍迪苷A (RA)的合成效率、节约生产成本，并为莱鲍迪苷A (RA)的生产加工开辟新的工业化途径就显得十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于克服现有技术中不足，提供一种共表达蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的重组毕赤酵母工程菌及其构建方法。

本发明所解决的技术问题还在于将共表达蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的重组毕赤酵母工程菌作为全细胞催化剂用于合成莱鲍迪苷A。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体线性化后转化毕赤酵母而获得：

编码蔗糖合成酶基因的DNA序列如SEQ ID NO. 3所示，

编码UDP-糖基转移酶的DNA序列如SEQ ID NO. 4所示。

其中，所述表达载体包括胞内表达载体和表面展示表达载体，所述胞内表达载体克隆有编码蔗糖合成酶基因的DNA序列，所述表面展示表达载体克隆有编码UDP-糖基转移酶的DNA序列。

优选地，所述胞内表达载体是将如SEQ ID NO. 3所示的DNA序列克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA而获得胞内表达载体pPICZA-Sus1；所述表面展示表达载体是将如SEQ ID NO. 3所示的DNA序列与锚定蛋白Gcw61编码基因融合后克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表面展示表达载体pGCW61- UGT76G1。

另外，本发明还提供了一种重组毕赤酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：

步骤一、编码基因的获取：以蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的氨基酸序列为基础，对序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的对应编码序列；其中，蔗糖合成酶Sus1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码序列如SEQ ID NO. 3所示；UDP-糖基转移酶UGT76G1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码序列如SEQ ID NO. 4所示；

步骤二、表达载体的构建：将步骤一获取的编码基因分别接入毕赤酵母的表达载体中，所述表达载体包括胞内表达载体和表面展示表达载体，所述胞内表达载体克隆有编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列，所述表面展示表达载体克隆有编码UDP-糖基转移酶UGT76G1的DNA序列；

步骤三、表达载体转化及重组毕赤酵母工程菌获取：将表面展示表达载体经酶切线性化并纯化后电转化至感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，从而得到初级重组毕赤酵母工程菌，再将胞内表达载体经酶切线性化并纯化后电转化初级重组毕赤酵母工程菌的感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌；或者，将将胞内表达载体经酶切线性化并纯化后电转化至感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，从而得到初级重组毕赤酵母工程菌；再将表面展示表达载体经酶切线性化并纯化后电转化初级重组毕赤酵母工程菌的感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌。