[发明专利]一种组织工程骨及其制备方法

权利要求书

1.一种组织工程骨，其特征在于所述的组织工程骨为具有三维毛细血管网的多层细胞片叠层化物，所述的多层细胞片叠层化物由n片叠置的骨髓间充质干细胞片及填充于各骨髓间充质干细胞片间的血管内皮细胞构成，n=3~8。

2.制备如权利要求1所述的组织工程骨的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）制备光敏的细胞培养皿

    将光响应纳米颗粒分散于去离子水中配成质量浓度为10~20%的分散液，再将分散液与醇和有机溶剂按摩尔比为0.02~0.06:6~9:1~3的比例配制成前驱体溶液，将前驱体溶液滴至聚苯乙烯培养皿至其铺满，烘干并消毒，得到光敏的细胞培养皿；所述的光响应纳米颗粒为纳米氧化钛、纳米氧化锌或纳米氧化铁，醇为甲醇或乙醇，有机溶剂为四氢呋喃、三氯甲烷或二氯甲烷；

2）培养骨髓间充质干细胞片

取骨髓间充质干细胞，以5×10⁴~2×10⁵个/cm²的密度植入步骤1）的光敏的细胞培养皿中，加入骨髓间充质干细胞专用培养基培养4~10天后，采用波长320~450nm、强度1~4mW/cm²的光从培养皿底部射入，照射至光敏的细胞培养皿中骨髓间充质干细胞成片脱落，获得骨髓间充质干细胞片；

3）构建组织工程骨

    将步骤2）得到的骨髓间充质干细胞片转移至细胞培养皿中，待其贴壁后，加入骨髓间充质干细胞专用培养基，在37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养2~48h后，以5×10⁴~2×10⁵个/cm²的密度在其上植入血管内皮细胞，再在37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养2~48h，吸除骨髓间充质干细胞专用培养基后，在上述结构上再转移一片骨髓间充质干细胞片，加入骨髓间充质干细胞专用培养基，在37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养2~48h；

在上述结构上再以5×10⁴~2×10⁵个/cm²的密度在其上植入血管内皮细胞，在37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养2~48h，吸除骨髓间充质干细胞专用培养基后，再次转移骨髓间充质干细胞片，并加入骨髓间充质干细胞专用培养基，在37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养2~48h，重复上述的过程直至该结构具有n层骨髓间充质干细胞片，n=3~8，获得多层细胞片叠层化物，向细胞培养皿内的骨髓间充质干细胞专用培养基中添加成骨细胞诱导因子及成血管细胞诱导因子，在37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下再培养4~10天，得到组织工程骨。

3.根据权利要求2所述的组织工程骨的制备方法，其特征在于所述的成骨细胞诱导因子为抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松中的一种或多种，所述的成血管细胞诱导因子为血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种。