[发明专利]一种组织工程骨及其制备方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种组织工程骨及其制备方法，具体涉及一种由多层细胞片构成的组织工程骨及其制备方法，属于组织工程领域。

背景技术

由于先天畸形、外伤、肿瘤等造成的骨组织缺损和缺失是临床常见的疾病，因此对骨组织缺损的功能性重建修复一直是再生医学的重要课题。传统的治疗方法常采用自体或异体骨移植，但往往因供源有限或免疫排斥反应等而限制了其临床应用。组织工程技术作为目前人工骨替代材料中应用最为广泛的一种，通过其生物可降解性被逐渐替换。如CN103285427A公开的《一种人工骨材料及其制备方法》，即采用适宜比例羟基磷灰石、胶原和纳米纤维素合成人工骨，具有良好的强度及降解性能。CN103157138A公开的《一种组织工程骨修复材料的构建方法》，则采用可注射型壳聚糖-β-磷酸三钙复合骨髓基质干细胞作为组织工程骨，可任意塑形且完全降解吸收，诱导成骨效应明显。然而，常规组织工程技术的细胞粘附主要通过修复区周边细胞的爬行或将相应细胞悬液滴定于材料表面或缺损区，细胞粘附利用率低、修复周期长，其大小、形状及定位也很难控制；同时，滴定细胞悬液往往形成散在岛状修复区，对于大片组织缺损并不适用；另外，应用传统组织工程所构建的生物骨组织植入宿主后其内毛细血管生长缓慢，不利于骨组织的生长、改建及支架材料降解，故构建具有初期血管化的新型组织工程骨对于骨组织的修复及重建具有重要的意义。

    细胞薄层培养技术（Tang Z, Akiyama Y, Yamato M, Okano T. Comb-type grafted poly(N-isopropylacrylamide) gel modified surfaces for rapid detachment of cell sheet.Biomaterials (2010) ;31(29):7435-43. Nagase K, Kobayashi J, Kikuchi A, Akiyama Y, Kanazawa H, Okano T. Thermally-modulated on/off-adsorption materials for pharmaceutical protein purification. Biomaterials. (2011) ;32(2):619-27.）作为一种新型组织工程方法，具有其独特的优势。其通过相应中介物质或控制贴壁细胞所生长培养皿底部疏水-亲水转换从而控制细胞成片粘附生长和剥离，此“细胞片”多层叠加或复合培养后，无需包裹材料，本身即可作为一种“生物支架”植入缺损部位。相较胰酶作用获得的细胞，其并未破坏细胞间的蛋白连接及细胞同底部基质间的连接，细胞活性更好；同时，细胞薄层培养技术还可避免降低在组织修复时因使用生物降解支架材料而造成高污染的问题。CN103097518A和CN103180437A公开的《细胞片叠层化物的制造方法、由该方法得到的具有血管网的细胞片叠层化物及其利用方法》，即通过温敏细胞培养皿获得细胞片，将多层细胞片叠加形成复层细胞片叠层化物，并将其整体培养于含流路凝胶或动静脉袢构成的血管床上，得到了含血管网的心肌组织。然而，温控的条件相对复杂，对于设备要求较高，温度的间或改变亦影响细胞的活性，加速部分细胞老化，对于温度更为敏感的人成骨类细胞并不适用（Fukumori K, Akiyama Y, Yamato M, Kobayashi J, Sakai K, Okano T. Temperatureresponsive glass coverslips with an ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) layer. Acta Biomater 2009;5:470-476）。

发明内容

    本发明的目的在于提供一种具有血管网状结构的由多层细胞片构成的组织工程骨及其制备方法。

    本发明的组织工程骨为具有三维毛细血管网的多层细胞片叠层化物，所述的多层细胞片叠层化物由n片叠置的骨髓间充质干细胞片及填充于各骨髓间充质干细胞片间的血管内皮细胞构成，n=3~8。

制备上述组织工程骨的方法，包括如下步骤：

1）制备光敏的细胞培养皿