[发明专利]流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及流式细胞术的技术应用，特别涉及流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用。

背景技术

疫苗生产过程中菌液发酵过程的控制是疫苗生产的关键环节。温度、pH值、培养液的营养状态等多种因素均影响菌液的发酵过程。因此建立简便、快速、可靠的细菌活性检测方法对疫苗生产的监控具有实际意义。传统的监控疫苗生产的方法主要有培养计数法和比浊计数法，目前疫苗生产厂商对疫苗质量的控制仍然依赖于这两种方法。培养法灵敏度高但耗时长，通常需要24h以上才能获得结果，不能达到即时控制菌液发酵过程的目的；比浊法操作简单但采用肉眼观察，检测灵敏度差，且不能区分活菌和死菌。

因此，急需一种能实时监控疫苗生产过程中活菌数目的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，是将流式细胞术方法应用于疫苗生产过程中，检测疫苗生产过程中的活菌数；

所述的疫苗包括大肠杆菌疫苗、葡萄球菌疫苗、猪丹毒疫苗、链球菌疫苗、沙门氏菌疫苗、魏氏梭菌疫苗、鸡毒支原体疫苗、多杀性巴氏杆菌疫苗和副猪嗜血杆菌疫苗等等。

所述的流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，优选包含如下步骤：

(1)选择如下所述的荧光染料中的至少两种着染目标菌；荧光染料为对活菌细胞能进行染色的染料、对总菌数能进行染色的染料和对死菌细胞能进行染色的染料；

(2)然后用流式细胞仪检测细菌荧光信号的变化，通过测定细菌荧光信息的变化，得到FCM图谱；FCM图谱具有如下参数中的至少两种：活菌数、死菌数和总菌数；依据FCM图谱得到活菌数的比例；

(3)通过绝对计数法得到目标菌菌液的浓度；

(4)依据步骤(2)得到的活菌数的比例和步骤(3)得到的目标菌菌液的浓度，得到目标菌的活菌量和死菌量。

步骤(1)优选为：选择如下所述的荧光染料着染目标菌；荧光染料为对活菌细胞能进行染色的染料和对总菌数能进行染色的染料中的一种与对死菌细胞能进行染色的染料形成的组合；

步骤(1)中所述的对活菌细胞能进行染色的染料优选为CFDA-SE；荧光染料CFDA-SE可以进入细胞膜，被菌体细胞内的酯酶酶解后发出荧光，为膜渗透性染料；酶解后产物不能穿过细胞膜，染色为不可逆性，因此CFDA-SE只能染色活菌细胞；

步骤(1)中所述的对总菌数能进行染色的染料优选为SYBR Green I；SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，能与所有的双链DNA相结合，与双链DNA结合后，发出绿色荧光，且荧光大大增强；其最大吸收波长约为497nm，发射波长最大为520nm，SYBR Green I可染色所有活菌和死菌；

步骤(1)中所述的对死菌细胞能进行染色的染料优选为PI；PI(碘化丙啶，Propidium Iodide)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，PI为膜非渗透性染料，不能通过活细胞膜，但能穿过破损的细胞膜而对核染色，在嵌入双链DNA后释放红色荧光；

步骤(3)中所述通过绝对计数法得到目标菌菌液的浓度可通过血球计数板计数或通过流式细胞仪计数；

所述的通过流式细胞仪计数优选为通过如下步骤实现：将已知浓度的磁珠和所述的目标菌菌液混合，通过流式细胞仪检测，通过如下公式计算得到目标菌菌液的浓度；

公式为：

(菌细胞数/磁珠数)×(每管内总磁珠数/样品总体积)×稀释倍数＝菌液浓度；

菌细胞数指一定时间内流式细胞仪检测到的菌细胞数；磁珠数指一定时间内流式细胞仪检测到的磁珠数；每管内总磁珠数指样品检测管内的磁珠总数；稀释倍数指菌液的稀释倍数。

所述的磁珠的粒径优选为5.5μm；

所述的流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，更优选包含如下步骤：

I、建立菌细胞的空白对照和荧光强度补偿对照，确定流式细胞仪的操作参数：

①将目标菌活化，培养至对数生长期；将其中的一部分菌液灭活，灭活的菌液作为死菌对照；未经处理的菌液，为活菌对照；

②用PBS将步骤①得到的两种细胞分别洗涤，然后用PBS重悬至OD₆₀₀为0.002～0.006，得到死菌对照菌液和活菌对照菌液；

③得到菌细胞的空白对照和荧光强度补偿对照：