[发明专利]一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法无效
| 申请号： | 201410493854.8 | 申请日： | 2014-09-24 |
| 公开（公告）号： | CN104195263A | 公开（公告）日： | 2014-12-10 |
| 发明（设计）人： | 刘彦威;刘娜;刘利强;杜鹃;刘建钗;张永英;朱美霞;刘贵巧 | 申请（专利权）人： | 河北工程大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/04 |
| 代理公司： | 石家庄元汇专利代理事务所(特殊普通合伙) 13115 | 代理人： | 刘闻铎 |
| 地址： | 056038 河*** | 国省代码： | 河北;13 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 sybr green 荧光 定量 pcr 检测 兔须癣毛癣菌 方法 | ||
1.一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)引物合成：
上游引物F：5'-GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3'，
下游引物R：5'-GGAGACCATCTGTGAGAGTTG-3；
(2)标准阳性样品制备：提取标准阳性重组菌的质粒DNA，稀释为不同拷贝数梯度；
(3)待测样品制备：按Solarbio试剂盒说明书的步骤提取待测样品DNA；
(4)SYBR Green I荧光定量PCR：以标准阳性样品和待测样品分别为模板，F和R为引物进行SYBR Green I荧光定量PCR反应；
(5)绘制标准曲线和溶解曲线：根据标准阳性样品进行SYBR Green I荧光定量PCR反应结果，绘制标准曲线和溶解曲线；
(6)结果判定：当待测样品SYBR Green I荧光定量PCR反应曲线呈“S”型，且Ct值≤36.5、Tm值介于86.48℃～86.65℃之间，判定待测样品中含有须癣毛癣菌；若反应曲线为一条直线，则判断样品中不含须癣毛癣菌。
2.根据权利要求1所述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，在步骤(2)中，标准阳性重组菌的质粒DNA的OD260/OD280介于1.8～2.0之间。
3.根据权利要求1或2所述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，在步骤(2)中，拷贝数梯度为1.0×109～1.0×10拷贝/μL的9个梯度。
4.根据权利要求3所述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，在步骤(4)中，SYBR Green I荧光定量PCR反应体系为：2X的SYBR Premix Ex Taq12.5μL，10pmol/L的上游引物F、下游引物R各1.0μL，DNA模板2.0μL，用灭菌超纯水补足至25.0μL。
5.根据权利要求4所述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，在步骤(4)中，SYBR Green I荧光定量PCR反应程序为：94℃预变性60s；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸50s，进行40个循环。
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