[发明专利]一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种兔须癣毛癣菌感染的检测方法，具体涉及一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，属于分子生物学领域。

背景技术

须癣毛癣菌是家兔等多种动物皮肤真菌病的最常见病原之一，主要侵害皮肤及其附属物，表现皮屑增多、结痂、脱毛、渗出、毛囊炎及痒感等症状，导致兔营养不良、生长迟缓等，给养兔业带来巨大经济损失。更严重的是，该病还能传染给人，引起人畜共患传染病。所以需要找到一种快速，准确的检测方法，以便及时治疗和控制疫情。

目前，常见的检测方法包括：病料直接显微观察法、病原分离培养法。病料直接显微观察法虽然简单、快速，但却无法鉴别真菌的种类，而且有5-15％的假阴性率；病原分离培养虽然通过菌落、菌丝、孢子的形态，结合生化试验，可以明确真菌种类，但耗时长，一般为3-4周，而且有40％的假阴性率。

随着技术的发展，分子生物学方法检测真菌感染得到了一定的应用，包括染色体DNA G+C的含量、总DNA同源性、线粒体DNA限制酶断片长度多态分析、随机引物PCR、随机扩增DNA多态性分析、PCR指纹等。其中，采用核糖体DNA区及rRNA小亚基序列分析，特别是ITS(analysis of internal transcribed spacer)区分析比对编码rRNA小亚基(18SrRNA)基因更适应对皮肤真菌的检测，目前，把核糖体DNA区的ITS区序列分析称为皮肤癣菌鉴定的金标准。此方法主要是利用常规PCR的方法对目的基因进行扩增，然后利用电泳观察，基因序列测定，序列分析等方法，最终通过同源性差异，对皮肤真菌病原做出诊断。但是此方法存在一定的缺陷，主要表现在常规PCR的灵敏度不是特别高、需要PCR后处理、电泳鉴定需要使用有毒性EB染料等方面。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测时间短、结果直观、敏感度高、定量准确的SYBR Green I荧光定量PCR方法用于兔须癣毛癣菌的检测。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)引物合成：

上游引物F：5'-GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3'，

下游引物R：5'-GGAGACCATCTGTGAGAGTTG-3；

(2)标准阳性样品制备：提取标准阳性重组菌的质粒DNA，稀释为不同拷贝数梯度；

(3)待测样品制备：按Solarbio试剂盒说明书的步骤提取待测样品DNA；

(4)SYBR Green I荧光定量PCR：以标准阳性样品和待测样品分别为模板，F和R为引物进行SYBR Green I荧光定量PCR反应；

(5)绘制标准曲线和溶解曲线：根据标准阳性样品进行SYBR Green I荧光定量PCR反应结果，绘制标准曲线和溶解曲线；

(6)结果判定：当待测样品SYBR Green I荧光定量PCR反应曲线呈“S”型，且Ct值≤36.5、Tm值介于86.48℃～86.65℃之间，判定待测样品中含有须癣毛癣菌；若反应曲线为一条直线，则判断样品中不含须癣毛癣菌。

前述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，在步骤(2)中，标准阳性重组菌的质粒DNA的OD260/OD280介于1.8～2.0之间。

前述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，在步骤(2)中，拷贝数梯度为1.0×10⁹～1.0×10拷贝/μL的9个梯度。

前述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，在步骤(4)中，SYBR Green I荧光定量PCR反应体系为：2X的SYBR Premix Ex Taq12.5μL，10pmol/L的上游引物F、下游引物R各1.0μL，DNA模板2.0μL，用灭菌超纯水补足至25.0μL。

前述的一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，在步骤(4)中，SYBR Green I荧光定量PCR反应程序为：94℃预变性60s；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸50s，进行40个循环。