[发明专利]一种用海藻酸钙-壳聚糖固定磷脂酶A2的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用海藻酸钙-壳聚糖固定磷脂酶A₂的方法。

背景技术

本文所指脂质酰基转移酶为一种磷脂酶A₂（PLA₂）。PLA₂是一类能够在磷脂甘油部分的Sn-2位点选择性断裂酯键的酶，其可将磷脂水解成一系列生物活性物质；本文所指脂质酰基转移酶也可将甾醇酯化为甾醇酯。PLA₂酶源来自猪胰腺，材料相对短缺，而且存在清真等宗教文化的接受问题，未推广开；但本文所指脂质酰基转移酶的来源为气单包菌属，不存在上述问题，易于推广。在上世纪90年代，德国Lurgi公司最早将Enzymax工艺用于酶法脱胶工业生产，此工艺采用的酶就是稳定的PLA₂，但是酶的消耗量很大，这样酶的重复利用便急需开发。国内也有不少相关报道，现今用于脱胶的酶主要是Novozymes公司推出的Lecitase 10L(PLA₂)，Lecitase Novo(PLA₁)和Lecitase Ultra(PLA₁)。其中，猪胰脏来源的磷脂酶Lecitase 10L已不用于油脂脱胶，而被更具优势的微生物来源的Lysomax oil(PLA₂)所代替。

但是，游离的Lysomax oil(PLA₂)价格昂贵，消耗量为100ppm，是Lecitase Ultra消耗量的两倍，不易回收，而且对反应环境适应性差。而对于固定化磷脂酶A₂来讲，其有以下优势：颗粒均匀且肉眼可见，易于将固定化酶、底物与产物分开，方便产物后续的纯化；酶的温度稳定性提高，最适pH值和最适温度改变，对温度和pH值适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶敏感性降低；可以增加产物的收率，即提高油产量和甾醇酯的产量；可以重复使用多次；脂质酰基转移酶反应条件更易得到控制；酶的使用效率高，使用成本低；相对游离酶而言，更适于产业化、连续化、自动化生产等。

制备固定化酶的方法主要有包埋、吸附、交联法和共价键结合等，其中包埋法不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，具有反应条件温和、很少改变酶分子结构、酶活力损失小等优点。海藻酸钙、壳聚糖是最为常见的包埋材料，因此可用其来作为固定化酶的载体。海藻酸钙、壳聚糖可与戊二醛基形成Schiff氏碱，在胶囊表面形成一层致密的保护膜，可增加微胶囊球的强度。以海藻酸钙-壳聚糖为包埋材料，戊二醛为交联剂，将脂质酰基转移酶固定化，最终选择出最优的固定化条件。

发明内容

本发明是为了解决酶法脱胶过程中，游离磷脂酶A₂消耗量大且不易回收的问题，而提出的用海藻酸钙-壳聚糖固定化脂质酰基转移酶（Lysomax oil）的方法，而且至今脂质酰基转移酶（Lysomax oil）固定化的方法及其应用仍未见报道。用海藻酸钙-壳聚糖复合载体固定化脂质酰基转移酶（Lysomax oil）的方法通过以下步骤实现：一、脂质酰基转移酶（Lysomax oil）的固定化；二、固定化酶酶活力的测定；三、测定酶活力进而计算酶活回收率；四、固定化条件的优化：分别在海藻酸钙浓度0.1%～5.0%，壳聚糖浓度为0.1%～5.0%，氯化钙浓度为0.1mol/L～2.0 mol/L，戊二醛浓度为0.1%～1.0%，交联时间为3h~10h的条件下，通过测定固定化酶活力回收率得到最佳的固定化条件；五、采用响应面法进行分析讨论最终确定最佳固定化条件。

采用海藻酸钙-壳聚糖作为载体固定化脂质酰基转移酶（Lysomax oil），海藻酸钙-壳聚糖作为载体，不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，具有反应条件温和、很少改变酶分子结构、酶活力损失小等优点；此外，海藻酸钙-壳聚糖固定化脂质酰基转移酶（Lysomax oil）最终得到的固定化酶微球机械强度好，酶的回收率可以达到80%，对于油脂精炼中的酶法脱胶工艺具有重要指导意义。

具体实施方式