[发明专利]鸡蛋清溶菌酶及其制备方法

权利要求书

1.一种鸡蛋清溶菌酶，其特征在于：其蛋白活性的多肽氨基酸编码序列为序列表400<1>所示序列，具体为：

KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSXGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL。

2.权利要求1所述的鸡蛋清溶菌酶的制备方法，其特征在于：具体构建步骤如下：

(1)获取鸡蛋清溶菌酶基因：根据Gene Bank中已发表的编码具有鸡蛋清溶菌酶蛋白活性的多肽氨基酸序列，合成了鸡蛋清溶菌酶的cDNA序列，并根据大肠杆菌表达宿主进行密码子的优化，所得多肽氨基酸序列为序列表400<1>所示序列；

(2)重组质粒的构建：用酶切连接的方法分别将上述鸡蛋清溶菌酶基因与载体pET-28a相连，得到携带鸡蛋清溶菌酶基因的重组表达载体pET28a(+)/LYZ，并进行双酶切验证；

(3)基因工程菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的基因工程菌株；

(4)基因工程重组鸡蛋清溶菌酶生产方法：通过在发酵条件下使工程菌株在IPTG的诱导下大量合成鸡蛋清溶菌酶，经提取、纯化后制成溶菌酶产品。

3.根据权利要求2所述的鸡蛋清溶菌酶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中所用的原核表达载体是大肠杆菌表达载体pET-28a，构建载体宿主细胞是大肠杆菌DH5α菌株，表达宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

4.根据权利要求2所述的鸡蛋清溶菌酶的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中重组溶菌酶的生产工艺为：重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)/LYZ接种于LB培养基中，在培养温度为37℃，摇床转速为180r/min条件下，培养至菌液OD值为0.4～0.6时，取出1mL菌液作为对照，剩下的部分加入终浓度为0.5～2mM/mL的IPTG进行诱导，诱导时间为4～6小时，诱导结束后12000r/min离心2～5min收集菌体，并将诱导前后的菌体煮沸后进行SDS-PAGE电泳，检测溶菌酶蛋白的表达，之后将获得的菌体经裂解、变性、复性等纯化提取后制成溶菌酶产品，再利用SDS-PAGE电泳检测溶菌酶的纯化效果。

5.根据权利要求4所述的鸡蛋清溶菌酶的制备方法，其特征在于：所述LB培养基的成分为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，通过常规方法制备而成。