[发明专利]鸡蛋清溶菌酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是鸡蛋清溶菌酶及其制备方法。

背景技术

溶菌酶(lysozyme)首先是从尼科辽(Nicolle)l907年发表枯草芽孢杆菌溶解因子的报告开始的。两年后，拉希琴科(Laschtscbenko)指出，鸡蛋清有强抑菌作用，是酶作用的结果。1922年，弗来明(Fleming)发现人的鼻涕、唾液、眼泪也有强力的溶菌活性，因其具有溶菌作用,被命名为溶菌酶。溶菌酶广泛存在于动物、植物和微生物中，是一种天然的抗菌剂，能特异性地作用于细胞壁N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,NAG)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid,NAM)之间的β-1，4糖苷键，破坏肽聚糖支架，使微生物细胞在内部渗透压的作用下涨裂，细胞质外泄，最终导致细胞死亡。溶菌酶的化学性质稳定，在pH值4-7范围内，100℃处理1min仍能保持原酶活性，对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌有很好的抑菌作用，对人和动物的细胞则不发生溶菌作用，被WHO和许多国家认定为无毒、无害、安全的添加剂,被越来越广泛地应用于医药、生物技术、食品以及动物生产中。

根据溶菌酶氨基酸序列和底物的差异，可以将溶菌酶大致分为3种类型：c型(鸡蛋清溶菌酶)、g型(鹅蛋清溶菌酶)和噬菌体溶菌酶。迄今为止，生产上应用最多的是鸡蛋清溶菌酶(hen egg white lsozyme)。鸡蛋清中溶菌酶的含量很丰富，约占蛋清总蛋白的3.4％-3.5％，作为溶菌酶类的典型代表，是结构了解最清楚的溶菌酶之一。它含有129个氨基酸，分子量约为14,300Da，鸡蛋清溶菌酶具有的广谱抗性使其在食品和医学等领域早已得到广泛地应用。溶菌酶制剂能有效防止球虫病，饲喂小麦基础日粮的鸡，添加和不添加酶对球虫病的应激呈现不同的反应，对照组鸡生长被抑制52.5％，而加酶组为30.5％，而且损伤系数要好得多。此外，溶菌酶还能改变肠道微生物群，增加肠道有益菌，使肠道内的胺、甲酚等有害物减少，增加机体抗病力，提高动物的生产性能。在不用任何抗生素情况下，于肉鸡饲料中添加饲用溶菌酶制剂，可促进鸡体的健康，增加体重和饲料报酬，减少死亡。饲用溶菌酶可以促进饲料中营养物质的消化、吸收，提高饲料的消化率，最大限度地提高饲料原料的利用率。

目前，我国主要采用蛋厂鸡蛋壳中残留的鸡蛋清为原料来生产鸡蛋清溶菌酶，其中相关的报道很多，有直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、沉淀法、双水相萃取、超滤法等。各种方法优缺点不一，产品的质量和生产成本也有所不同。沉淀法是一种工业上应用比较成熟的提取方法，其在技术要求和生产成本上都比较好。但自鸡蛋清中提取溶菌酶存在着生产成本高、生产工艺复杂、生产规模受限制等问题，难于满足越来越大的市场需求，因此寻找其他廉价的生产鸡蛋清溶菌酶的途径是非常有意义的，近年来人们正研究利用分子生物技术构建基因工程菌,通过发酵手段生产溶菌酶,将是提高溶菌酶产量,降低成本的有效手段之一。

鸡蛋清溶菌酶应用抗病基因工程研究最早起始于上世纪90年代初，1992年，Trudel等将鸡蛋清溶菌酶基因首次导入烟草并随后检测到转基因植株有溶菌酶活性。2000年，Carolina等通过农杆菌介导法将鸡蛋清溶菌酶基因导入到马铃薯中，结果表明14-20株转基因植株对细菌性软腐病的抗性增强。2007年，刘兴敏等人根据T4噬菌体溶菌酶的氨基酸序列，选用植物偏爱的密码子设计并人工合成了溶菌酶基因，导入宿主细菌E.coli BL21(DE3)pLysS，经IPTG诱导后，宿主菌在2h内全部被溶菌酶基因的表达产物裂解，说明该溶菌酶基因对细菌具有很强的抗性。2008年，李斌等将鸡蛋清溶菌酶基因LYZ插入表达载体pET15b，获取大量高纯度鸡蛋清溶菌酶，其纯度达90％以上，为利用大肠杆菌系统规模化生产重组鸡蛋清溶菌酶奠定了技术基础。

而当今动物疾病盛行，抗生素在预防治疗畜禽疾病起到了不可磨灭的作用，但考虑到其相关副作用，人们不得不去寻求一种安全、高效的饲用抗生素替代品，这已成为本世纪畜牧工作者面临的迫切问题。早己应用与医疗、食品等行业的溶菌酶引起了饲料行业的注意。然而当前商品化溶菌酶多为鸡蛋清提取，较高的成本限制了其在畜禽养殖和饲料工业中的应用。国内一些企业抓住时机，通过生物技术已工业化生产出大量溶菌酶，且成本较低。由于溶菌酶是初次应用于该行业，目前市场畜禽应用溶菌酶的报道极少，因而对这种新的产品在市场推广应用之前，饲料行业急需在畜禽中的应用效果评价的相关报道。本试验正是基于此目的，对溶菌酶在肉鸡中的应用作一有效性评价，探讨其作为安全添加剂替代抗生素应用可能性，具有广泛的社会意义。

发明内容