[发明专利]一种无抗生素标记的裂殖壶菌及其遗传转化方法

权利要求书

1.一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌，其分类命名为Aurantiochytrium limacinum OUC_EG，保藏编号为CGMCC No.9631。

2.根据权利要求1所述的一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌，其特征在于：是利用Cre/loxP位点特异性重组系统，第一步将载体p18SCPGC质粒转入到宿主菌裂殖壶菌中，第二步将pSH65质粒转入到第一步的阳性克隆中，pSH65质粒在裂殖壶菌细胞内表达Cre重组酶，将loxP序列中间的抗性基因剔除而得到的，所述载体p18SCPGC质粒如说明书附图图1所示。

3.根据权利要求2所述的一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌，其特征在于：所述载体p18SCPGC中含有18srDNA序列、氯霉素抗性基因Cm^r、绿色荧光蛋白报告基因EGFP以及loxP序列。

4.根据权利要求3所述的一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌，其特征在于：所述载体pSH65质粒含有Cre重组酶、氨苄青霉素抗性基因Amp^r和博莱霉素抗性基因Ble^r。

5.根据权利要求4所述的一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌的遗传转化方法，其特征在于：具体步骤包括：

[1]裂殖壶菌感受态细胞的制备：将裂殖壶菌单菌落接种入裂殖壶菌液体培养基中，得到培养液1；按照1:5的体积比将培养液1转接于裂殖壶菌液体培养基中，得到培养液2；按照1:200的体积比将培养液2转接于裂殖壶菌液体培养基中，得到培养液3；将培养液3离心后，弃上清液，得到沉淀1；在沉淀1中加入1倍于培养液3体积预冷的无菌水重悬，离心，去上清，得到沉淀2；在沉淀2中加入1倍于培养液3体积预冷的山梨醇溶液重悬，离心，去上清，得到沉淀3；在沉淀3中加入1/10于培养液3体积预冷的山梨醇溶液重悬，置于冰上备用；

[2]两步电转化：将体积比为1:4的载体DNA和预冷裂殖壶菌感受态细胞混合液转移至预冷的电击杯中，确保混合液位于电击杯底，置于冰上备用，所述第一步中的载体为p18SCPGC质粒，第二步中的载体为pSH65质粒；将已加入混合液的电击杯外壁擦干，置于电转化仪中，进行电击；电击结束后，在电击杯中加入含山梨醇的裂殖壶菌液体培养基，所述山梨醇溶液与裂殖壶菌液体培养基的体积比为1:10，混匀；吸取电击杯中的混合液，并转移到1.5ml的离心管中，在23℃的条件下，200rpm恢复培养1h；将菌液涂在含有抗生素的固体培养基上避光培养，所述第一步转化的抗生素为氯霉素Cm，第二步转化的抗生素为博莱霉素Zeocin；

[3]第一步转化阳性克隆的筛选：将经过第一步转化的裂殖壶菌涂布在含Cm的固体培养基上避光培养，以氯霉素抗性基因Cm^r两侧序列为引物，对重组子进行PCR筛选，扩增得到的DNA片段经测序比对，与p18SCPGC载体的Cm^r片段一致的重组子为阳性克隆；

[4]第二步转化阳性克隆的筛选：将经过第二步转化的裂殖壶菌涂布在含有Cm和Zeocin的固体培养基上避光培养，筛选候选菌株；将候选菌株在半乳糖诱导培养基中200rpm避光培养；培养液分别涂布在含有Cm和Zeocin抗性的固体培养基上，选取可以在Zeocin固体培养基上生长，但不能在Cm固体培养基上生长的菌株，将其在不含Zeocin的固体培养基上进行传代培养，直至Zeocin抗性消失，得到无抗生素标记的转基因裂殖壶菌。

6.根据权利要求5所述的一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤[1]中离心的温度为4℃，转速为8000g，离心时间为5min。

7.根据权利要求5所述的一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤[1]中得到所述培养液1的培养温度为23℃，转速为200rpm培养时间为12-16h；得到所述培养液2的培养温度为23℃，转速为200rpm培养时间为12-16h；得到所述培养液3的培养温度为23℃，转速为200rpm培养时间为5-6h。

8.根据权利要求5所述的一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌的遗传转化方法，其特征在于：所述山梨醇溶液的浓度为1mol/L。