[发明专利]一种无抗生素标记的裂殖壶菌及其遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术和生物工程技术领域，具体地说，是一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌及其制备方法。

背景技术

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid，DHA)是一种n-3多不饱和脂肪酸，在婴幼儿神经系统的发育、保护视力、抗癌、抗炎及心血管病等方面有重要作用。裂殖壶菌(Aurantiochytrium，又称裂殖壶藻或裂壶藻)中DHA含量可达细胞干重的40％左右，而且其生长快速、易于培养，是一种理想的工业化DHA生产菌。进一步提高裂殖壶菌的DHA含量一直是人们追求的目标，培养条件和发酵条件的优化可以在一定程度上提高DHA产量，但是效果并不明显；而随着现代生物技术的迅速发展，基因工程方法为从根本上提高裂殖壶菌的DHA合成能力提供了可能。

目前裂殖壶菌已成功实现了遗传转化，Lippmeier等(2009)利用基因枪法成功的将Zeocin抗性基因导入裂殖壶菌内。2011年YangaS等通过农杆菌介导转化实现了裂殖壶菌的转化。Cheng等(2011)通过电转化，以18srDNA为靶位点，将Zeocin抗性基因成功转入到裂殖壶菌的基因组中。李清(2013)等用电转化方法成功敲除了裂殖壶菌pks基因的部分序列。但是转化后的裂殖壶菌都带有抗生素标记基因，不利于裂殖壶菌的应用，为此发明一种剔除裂殖壶菌遗传转化中抗生素标记的方法具有重要意义。

Cre/loxP位点特异性重组系统是Steinberg等首先在大肠杆菌噬菌体p1中发现的,由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre/loxP系统中，含有loxP位点的质粒首先被转入到宿主菌中，然后可以表达Cre重组酶的pSH65质粒被转入到宿主菌中，并特异性的识别loxP位点，根据loxP位点的方向对目的片段进行特异性的倒位、剔除或易位。Cre/loxP系统的优点在于可以将第一步转入宿主菌中的抗性标记特异性剔除，而第二步中的pSH65质粒会随着宿主菌的传代培养而丢失。本发明将Cre/loxP系统应用到裂殖壶菌遗传转化中，发明一种无抗生素标记的裂殖壶菌遗传转化方法。

发明内容

本发明的目的是发明一种无抗生素标记的裂殖壶菌及其遗传转化方法，解决转基因裂殖壶菌中含有抗生素基因的问题，为采用基因工程方法改造裂殖壶菌，在工业生产中应用奠定基础。

本发明的一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌，其分类命名为Aurantiochytrium limacinumOUC_EG，保藏编号为CGMCCNo.9631，保藏单位名称是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2014年9月2日。

本发明的无抗生素标记的转基因裂殖壶菌，是利用Cre/loxP位点特异性重组系统，第一步将载体p18SCPGC质粒转入到宿主菌裂殖壶菌中，第二步将pSH65质粒转入到第一步的阳性克隆中，pSH65质粒在裂殖壶菌细胞内表达Cre重组酶，将loxP序列中间的抗性基因剔除而得到的。

其中所述载体p18SCPGC中含有18srDNA序列、氯霉素抗性基因Cm^r、绿色荧光蛋白报告基因EGFP以及loxP序列。其中所述载体pSH65质粒含有Cre重组酶，氨苄青霉素抗性基因Ampr和博莱霉素抗性基因Ble^r。。

本发明的无抗生素标记的转基因裂殖壶菌的遗传转化方法，具体步骤包括：

[1]裂殖壶菌感受态细胞的制备：将裂殖壶菌单菌落接种入裂殖壶菌液体培养基中，得到培养液1；按照1:5的体积比将培养液1转接于裂殖壶菌液体培养基中，得到培养液2；按照1:200的体积比将培养液2转接于裂殖壶菌液体培养基中，得到培养液3；将培养液3离心后，弃上清液，得到沉淀1；在沉淀1中加入1倍于培养液3体积预冷的无菌水重悬，离心，去上清，得到沉淀2；在沉淀2中加入1倍于培养液3体积预冷的山梨醇溶液重悬，离心，去上清，得到沉淀3；在沉淀3中加入1/10于培养液3体积预冷的山梨醇溶液重悬，置于冰上备用；