[发明专利]一种扎伊尔型埃博拉病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括下列组成：

(1)RNA提取试剂；

(2)恒温扩增反应液：包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条扩增交叉引物、1×Thermol Buffer，MgSO₄，dNTPs溶液，Bst DNA聚合酶，AMV逆转录酶和无菌双蒸水；

所述正向外围引物为：5′-TGGTTCAAGTGCACAGTCAA-3′；

反向外围引物为：5′-TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3′；

所述两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针5′-Biotin-GCAAGGGTTGTCAGATGCG-3′；

反向3’端FitC标记探针5′-Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAAC

TTGAC-3′；

所述两条扩增交叉引物分别为：

扩增正向引物：

5′-AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3′；

扩增反向引物：

5′-CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3′；

(3)阳性对照：含有扎伊尔型埃博拉病毒的糖蛋白DNA质粒；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

2.如权利要求1所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述1×Thermol Buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

3.如权利要求1所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照为含有长189bp的扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因序列，序列如下：

TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCACGAGTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATCTCTGAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。

4.如权利要求1所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照按如下步骤制备：

以包含扩增区域的埃博拉糖蛋白基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A₂₈₀定量并稀释至10个拷贝/μl，-20℃保存。

5.如权利要求1所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述恒温扩增反应液组成为：两条外围引物各自10pmol，两条探针各自20pmol，两条交叉引物各自40pmol，1×Thermol buffer，MgSO₄为6mmol，dNTPs溶液各0.4mmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，无菌双蒸水组成补足至25μl。

6.一种权利要求1所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒的应用，其特征在于所述应用为：

a)用试剂盒中RNA提取液从待检测的标本中提取RNA；

b)将步骤a)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在58℃下扩增反应35分钟；阳性对照PCR管中加入标准阳性模板，阴性对照PCR管中加入标准阴性模板，所述阳性对照模板为含有扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因片段的质粒，所述阴性对照模板为无菌双蒸水；

c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有扎伊尔型埃博拉病毒核酸。