[发明专利]一种扎伊尔型埃博拉病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种针对扎伊尔型埃博拉病毒核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对扎伊尔型埃博拉病毒的定性检测。

(二)背景技术

埃博拉出血热是由埃博拉病毒感染引起的一种高度接触性烈性传染病，感染人类后可引起严重的急性出血热，易人传人，致死率高达70-90％。埃博拉病毒具有囊膜，基因组不分节段，为单链负股RNA，属于单负股病毒目丝状病毒科丝状病毒属。埃博拉病毒含有一个线性RNA基因组，长约19Kb，含有7个基因，依次编码核蛋白(NP)、病毒结构蛋白(VP35，VP40)、糖蛋白(GP)、额外病毒结构蛋白(VP30，VP24)、RNA依赖RNA聚合酶(L)。埃博拉出血热需要通过实验室手段确诊，常用的方法有病毒分离、电镜观察、常规PCR、免疫荧光、荧光定量PCR和ELISA等。这些方法或是操作复杂，费时、费力，或是敏感度不够，需要特殊仪器设备等，不能快速获得结果，亟待需要一种快速、简单、准确的检测方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测扎伊尔型埃博拉病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：

(1)RNA提取试剂(优选德国QIAGEN RNA提取试剂盒(Qia-74104))；

(2)恒温扩增反应液：包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermol Buffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

外围正向引物：5′-TGGTTCAAGTGCACAGTCAA-3′；

外围反向引物：5′-TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3′；

所述两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针：

5′-Biotin-GCAAGGGTTGTCAGATGCG-3′；

反向5’端Fitc标记探针：

5′-Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAACTTGAC-3′；

所述两条扩增交叉引物分别为：

扩增正向引物：

5′-AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3′；

扩增反向引物：

5′-CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3′；

(3)阳性对照：含有扎伊尔型埃博拉病毒的糖蛋白DNA质粒；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

进一步，本发明所述的1×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

进一步，本发明所述阳性对照为含有长189bp的扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因序列，序列如下：

TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCACGAGTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATCTCTGAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。

进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：

以包含扩增区域的埃博拉糖蛋白基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒(Promega)对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒(Promega)构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A₂₈₀定量并稀释至10个拷贝/μl，-20℃保存。