[发明专利]一种基于实时荧光PCR检测HLA‑B*5801等位基因的方法

权利要求书

1.用于荧光PCR反应高特异性扩增HLA-B*5801等位基因的引物探针组合，包括：

上游引物Fp：5’‐AGGGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’；

下游引物Rp:5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’；

MGB探针：5’‐HEX/VIC‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–MGB‐3’；

其中，HEX为6‐carboxy‐hexachlorofluorescein。

2.一种基于实时荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，用于非疾病诊断目的，主要包括以下环节：

(1)针对HLA‐B*5801等位基因设计特异性引物和探针，即权利要求1所述的引物探针组合；并设计内参基因的引物和探针；

(2)获得抽提的待测样本基因组DNA；

(3)在同一个反应体系中，将待测样本基因组DNA与所述引物探针组合以及内参基因的引物和探针按照确定比例混合；

(4)通过Applied Biosystem 7500或者LightCycler System480进行实时定量荧光PCR检测，其中分别利用FAM通道和VIC通道进行双通道荧光采集；

(6)分析判断待测样本是否携带HLA‐B*5801等位基因。

3.根据权利要求2所述的基于实时荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于，环节(1)中设计内参基因β‐actin引物和探针为：

上游引物Actin‐F:5’‐CAGCAGATGTGGATCAGCAAG‐3’；

下游引物Actin‐R:5’‐GCATTTGCGGTGGACGAT‐3’；

探针probe:5’‐FAM‐AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2‐3’；

其中，FAM为6‐carboxyfluorescein；BHQ2为Minor Groove Binder。

4.根据权利要求3所述的基于实时荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于：使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行PCR扩增，所述反应体系以20μL计，则包括：10μL Premix Ex Taq(2×)、HLA‐B*5801特异性上游引物Fp 250nM‐500nM、下游引物Rp 250nM‐500nM、MGB探针100nM‐250nM、以及ACTB特异性上游引物Actin‐F100nM‐250nM、下游引物Actin‐R 100nM‐250nM、探针probe 50nM‐250nM，然后加入待测样本基因组DNA10ng‐50ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；

扩增程序为：95℃预变性30s；95℃ 5s～10sec，64℃ 34s～40sec，共计35～40个循环。