[发明专利]一种基于实时荧光PCR检测HLA‑B*5801等位基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于药物基因组学和基因检测领域，具体涉及一种检测HLA‐B*5801等位基因的方法。

背景技术

HLA是指人类白细胞抗原，由人类第6号染色体短臂一群密切连锁的复等位基因编码，由360万个碱基对组成，是当前已知的人类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域。主要包括HLA‐A、HLA‐B、HLA‐C、HLA‐DR、HLA‐DQ及HLA‐DP。世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的相关HLA等位基因已达到5000多个；HLA基因的多态性决定了个体间表达的HLA蛋白分子不同，也决定了不同个体处理和呈递同一种抗原的能力不同，这是免疫应答诱导和调节的最基本点，从而使不同个体对同一种抗原的免疫应答可表现出个体差异。这种个体差异或产生保护性免疫，或形成免疫耐受,或出现自身免疫倾向，或表现为HLA相关疾病。如：HLA‐B*5801、HLA‐B*1502等位基因均与药物的过敏反应相关。因此，鉴于HLA系统的高度多态性和复杂性，决定了HLA等位基因的检测方法不同于普通多态性位点的检测。其中已有大量研究证明别嘌呤醇相关的严重超敏反应与白细胞抗原HLA‐B*5801密切相关，在服用别嘌呤醇后出现严重不良反应的患者中100％存在，而在未出现不良反应的患者(耐受人群)和正常对照组中，其携带率仅为15％和20％；，中国汉族、泰国人中HLA‐B*5801阳性者比白人高(6‐8％vs 2％)，发生超敏反应的风险更大。

别嘌醇(Allopurinol)为次黄嘌呤的异构体，是黄嘌呤氧化酶(XO)的抑制剂，可阻止次黄嘌呤和黄嘌呤代谢为尿酸，从而减少尿酸的生成，是目前唯一能抑制尿酸合成的药物，在高尿酸血症等症的治疗领域发挥着重要作用。临床主要用于：①原发性和继发性高尿酸血症，尤其是尿酸生成过多而引起的高尿酸血症；②反复发作或慢性痛风者；③痛风石；④尿酸性肾结石和(或)尿酸性肾病；⑤有肾功能不全的高尿酸血症。剂型为片剂。然而，随着药品的大量应用，其不良反应也日益凸显，是最易引起严重药疹的药物之一。别嘌醇的不良反应主要表现为皮肤、黏膜损害，最常见的是剥脱性皮炎，比较严重的有Stevens‐Johnson综合征、中毒性表皮坏死松解症、系统性疾病(嗜酸性粒细胞增多症、脉管炎、以及主要器官的疾病)。有文献报道别嘌呤醇皮肤变态反应致死率达20‐40％。

临床上已经建议在使用别嘌呤醇前，应该进行HLA‐B*5801等位基因的检测，以判断是否属于高危人群，从而有效降低由别嘌呤醇引起的严重不良反应。同时，美国风湿病协会发布指南建议对具有高风险的别嘌呤醇过敏综合征的亚群体进行HLA‐B*5801检测。因此，研究一种快速、特异性高的PCR法对HLA‐B*5801等位基因进行检测是非常必要的。

传统检测HLA等位基因分型检测的常用方法主要包括PCR‐SSOP(Sequence Specific Oligonucleotide Probes)和PCR‐SSP(Sequence‐specific primers)，是基于核酸序列识别的方法，这些方法大多成本低、重复性好，然而需要多次的PCR后处理，即操作复杂，又容易发生污染而产生假性结果。PCR‐SBT(Sequence‐based Typing)技术很大程度上弥补了PCR‐凝胶电泳技术的不足之处，可以精确地检测出样本是否携带HLA‐B*5801等位基因，此方法灵敏度高、特异性强，然而PCR‐SBT技术成本昂贵、耗时长、操作繁琐。