[发明专利]一种黄曲霉毒素半抗原、人工抗原及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种食品安全领域，尤其涉及的是一种黄曲霉毒素半抗原、人工抗原及其制备方法。

背景技术

黄曲毒素(aflatoxin)，也称作黄曲霉素，是一种有强烈生物毒性的化合物，常由黄曲霉及另外几种霉菌在霉变的谷物中产生，如大米、豆类、花生等，是目前为止最强的致癌物质。加热至280℃以上才开始分解，所以一般的加热不易破坏其结构。黄曲毒素主要有B1、B2、G1与G2等4种，又以B1的毒性最强。食米储存不当，极容易发霉变黄，产生黄曲毒素。

黄曲毒素与肝癌有密切关系，还会引起组织失血、厌食等症状。黄曲霉毒素中毒(Aflatoxicosis)主要对动物肝脏的伤害，受伤害的个体因动物种类年龄，性别和营养状态而异。研究结果表明黄曲霉毒素可导致肝功能下降，降低牛奶产量和产蛋率。并使动物的免疫力降低易受有害微生物的感染。此外，长期食用含低浓度黄曲霉毒素的饲料也可导致胚胎内中毒。通常年幼的动物对黄曲霉毒素更敏感。黄曲霉毒素的临床表现为消化系统功能紊乱降低生育能力。降低饲料利用率，贫血等。黄曲霉毒素不仅能够使奶牛的产奶量下降而且还使牛奶中含有转型的黄曲霉毒素M1和M2。据美国农业经济学家统计，由于食用黄曲霉毒素污染的饲料每年至少要使美国畜牧业遭受10％的经济损失。在中国，由此而带来的畜牧业损失可能会更大。黄曲霉毒素Bl的半数致死量为0.36毫克/公斤体重，属特剧毒的毒物范围(动物半数致死量<10毫克/公斤＝它的毒性比氰化钾大10倍比砒霜大68倍)。它引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎肝硬化，肝坏死等。黄曲霉毒素是目前发现的最强的致癌物质。其致癌力是奶油黄的900倍比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍，比3,4苯并芘大4000倍。它主要诱使动物发生肝癌也能诱发胃癌，肾癌直肠癌及乳腺，卵巢小肠等部位的癌症。

因此黄曲霉毒素的检测是农产品质量安全检测的一个重要指标。黄曲霉毒素等真菌毒素可以通过酶联免疫分析的方法进行检测，而目前免疫检测中所用的抗原载体大多是动物源的载体，不仅不够安全，而且存在一定的免疫缺陷，如敏感性较差，特异性不够高等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种黄曲霉毒素半抗原、人工抗原及其制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的，一种黄曲霉毒素半抗原AFB1-O-CMO，分子结构式为：

一种黄曲霉毒素半抗原AFB1-O-CMO的制备方法，包括以下步骤：

(1)甲醇：双蒸水：吡啶溶液按体积比为4:1:1的比例混合后，再将黄曲霉毒素与半羧基羟胺盐酸CMO按质量比1:2混合后溶解于上述混合溶液中；

(2)对步骤(1)所得混合物80～90℃加热回流3～4h，直到所有的黄曲霉毒素完全转化为黄曲霉毒素半抗原；

(3)用旋转蒸发仪将溶剂旋干，加水后，用2mol/L的H₂SO₄调节PH＝4，然后用5ml乙酸乙酯萃取2～3次，合并有机相，并用水洗涤至少2次，除去CMO，浓缩旋干液体，得到黄色油状半固态物质，即为黄曲霉毒素半抗原AFB1-O-CMO。

一种黄曲霉毒素人工抗原，所述人工抗原的分子结构式为：

所述载体蛋白Protein是大豆11S球蛋白酸性亚基。

一种黄曲霉毒素人工抗原的制备方法，采用EDC活性酯法合成，具体步骤如下：

(1)将黄曲霉毒素半抗原溶于2ml体积浓度为25％乙醇溶液中，称取4.5mg大豆11S球蛋白酸性亚基，溶于2ml纯水中，黄曲霉毒素半抗原与大豆11S球蛋白酸性亚基的投料摩尔比为60:1；

(2)加入50mg的EDC，室温下，避光搅拌反应48h；

(3)反应期间，再加入EDC各2次，每次50mg；

(4)反应产物在4℃搅拌下用PBS透析3天，每天换液3～6次，透析后得到纯化的AFB1-O-AS储存于-20℃。

所述大豆11S球蛋白酸性亚基的制备方法包括以下步骤：

(1)以1:5的体积比将大豆11S球蛋白溶于Tris-HCl缓冲液，加β巯基乙醇之后调节混合溶液的整体浓度至0.015mol.L^-1，调pH为8.0，在90℃条件下水浴30min；

(2)4℃，10000r·min^-1条件下离心20min，得到沉淀,调pH至5.0，冷冻干燥后即得大豆球蛋白碱性亚基；