[发明专利]一种富集纯化血小板的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种适用于包括人与实验动物在内不同种属高纯度血小板的离心制备方法。

背景技术：

血小板(platelet)是哺乳动物血液中的无核细胞，小于红细胞和白细胞，除了可以在止血的时候提供凝聚作用外，还能通过胞内α颗粒的脱颗粒作用释放大量细胞生长因子，包括血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，可诱导骨细胞的分裂增殖及胶原合成，促进骨组织的修复与重建(Marx RE,Implant Dent,2001,10(4):225-228)。其中，PDGF可促进成骨细胞的趋化、增殖，增加胶原蛋白的合成能力；TGF-β具有刺激成骨前体细胞及成骨细胞的趋化和增殖、抑制破骨细胞形成和骨吸收的作用；IGF-1能增加成骨细胞活力、促进软骨与骨基质生成；VEGF可促进新生血管形成，有利于病灶区营养物质的供给，还能直接作用于成骨细胞和软骨细胞，增强其迁移、增值和细胞活力(Bouletreau PJ,et al.,Plast Reconstr Surg,2002,110(1):139-148；Maeda S,et al.,EMOB J,2004,23(3):552-563；Trippel SB,Clin Orthop Relat Res.1998.(355Suppl):301-313；Ferrara N,et al.,Nat Med.2003.9(6):669-676)。血小板可从患者自身全血中提取，经富集处理后发挥治疗作用，具有来源丰富，取材方便，分离简单等特点，广泛应用于骨科、口腔科、运动医学等领域。现有的血小板手工制备方法是富血小板血浆(PRP)法，得到PRP用于实验研究和临床治疗。

PRP是全血经过离心分离得到的血小板浓缩物，其制备原理是利用血液中各种成分沉降速度不同，通过离心将血液分层。全血经低速离心可分为三层，上层是贫血小板血浆层(PPP)、中间为富血小板血浆层(PRP)、下层为红细胞层，取中间层可得到高度浓缩的含血小板血浆。一般认为，人体全血中血小板浓度为1～3×10⁵/ml，PRP中的血小板浓度应达到全血血小板浓度的4倍以上，含有的生长因子浓度也应在3倍以上(Marx et al.,Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,1998,85(6):638；Landesberg et al.,J Oral Maxillofac Surg,2000,58(3):297；Dugrillon et al.,Int J Oral Maxillofac Surg,2002,31(6):615.)。现有的PRP制备方法有一次离心法和二次离心法。公认的一次离心法是Anitua法，是将10～20ml全血加入5ml含抗凝剂的离心管中，以160g离心6分钟，上层是PPP，下层是红细胞，两层交界处可见一很薄的浅黄色层，即PRP层；弃去上层(PPP)1ml，吸取剩余上层血浆至下层(红细胞层)1～2mm，得到PRP(Anitua,Int J Oral Maxillofac Implants,1999,14(4):529-535.)。用Anitua一次离心法每次能从5ml全血中获取约1.2mlPRP。公认的二次离心法有Landesberg法、Petrungaro法和Aghaloo法，三者的区别是离心力和离心时间的不同。如Landesberg法第一次200g离心10分钟，吸管吸取全部上清液(PPP+PRP)至交界面下3mm，移至另一离心管，平衡后第二次200g离心10分钟，吸取约3/4上清液(PPP)废弃，剩余摇匀即为PRP；Petrungaro法第一次1500g离心6分钟，第二次1000g离心6分钟；Aghaloo法第一次215g离心10分钟，第二次863g离心10分钟(Landesberg et al.,J Oral Maxillofac Surg,2000,58(3):297-300；Petrungaro,Compend Contin Educ Dent,2001,22(9):729-732；Aghaloo et al.,J Oral Maxillofac Surg,2002,60(10):1176-1181.)。上述三种二次离心法的血小板数与血小板回收率比较可知，Aghaloo法获得的血小板数最多，回收率最高(张长青和袁霆,上海科学技术出版社,2011,p32-33.)。