[发明专利]一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法

权利要求书

1.一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于依次包括以下步骤：

（1）无菌苗的获得：取成熟的山蜡梅果实，剥出其长圆形的瘦果，用手术剪将瘦果两端各剪去少许，剥出带完整种皮的种子，在超净工作台中将其浸泡于质量分数0.2% 的HgCl₂溶液内消毒17-40 min，取出后无菌水浸泡冲洗3次，每次5 min；接种于添加了GA₃ 0.1 mg/L +6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2mg/L的Nitsch基本培养基中；此培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L， pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；在黑暗中培养7 d后，转入光照培养，培养温度为25±1℃；每光照培养14 h后转入黑暗中培养10 h，光照强度30-40 μmol/(m²·s)；种子萌发后，待两片子叶展开并变绿时可取子叶作为外植体，或待芽长出后取无菌苗的茎段作为外植体；

（2）愈伤组织的诱导和不定芽的诱导：

将子叶切下，用解剖刀分成1 cm²左右大小的小块，接种于添加了TDZ 0.1-2.0 mg/L+NAA 0-2.0 mg/L+PVP 0-5.0 mg/L+LH 0-1.0 mg/L的Nitsch基本培养基中，培养于光照培养室内，每光照培养14 h后转入黑暗中培养10 h，光照强度30-40 μmol/(m²·s)； 

（3）不定芽的增殖和壮苗：

将分化出的芽从愈伤组织上切下, 转入增殖培养基Nitsch+TDZ 0-2.0 mg/L+6-BA 0-5.0 mg/L+CH 0-5.0 mg/L+ PVP 1.0 mg/L进行增殖培养；

（4）无根苗的生根：

待不定芽生长3-4 cm高时，切取健壮的不定芽，接种于生根培养基12.5-100%Nitsch+IAA 0-1.0 mg/L +NAA0-0.5 mg/L+AC 0-2.0 mg/L+ CH 2.0 mg/L中；

（5）组培再生植株的炼苗和移栽：

待生根的组培苗再生植株的苗高5 cm、根数超过3根，根长超过5 cm时，即可进行炼苗，炼苗在光照培养室内进行；首先将组培瓶的瓶盖旋开，让内外空气交流，往瓶中添加少量清水，12 h后可使瓶盖盖住半个瓶口，一半的空间接受日光灯的照射，再过12 h后，取下组培瓶盖，让日光灯完全照射再生植株，3 d后，用玻璃棒将培养基捣碎，小心将再生植株取出，于清水中仔细漂洗剩余的琼脂，将洗净琼脂的再生植株根部埋入培养土中，于植株上面罩上透明容器，待再生植株定植抽出新的叶片后，即可取下容器。

2.根据权利要求1所述的一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：在所述步骤（2）中的Nitsch基本培养添加了TDZ 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 1.0 mg/L+LH 0.5 mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：在所述步骤（3）中的增殖培养基为Nitsch+TDZ 0.3 mg/L +6-BA 1.0 mg/L+CH 2.0 mg/L+ PVP 1.0 mg/L。

4.根据权利要求1所述的一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：在所述步骤（4）中的生根培养基为50% Nitsch+IAA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L+AC 0.2 mg/L+ CH 2.0 mg/L。

5.根据权利要求1所述的一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：在所述步骤（2）为丛生芽的诱导：待无菌苗的芽长到4 cm时，切下接种于Nitsch+TDZ 0-2.0 mg/L +6-BA 0-5.0 mg/L+ PVP 0-5.0 mg/L+LH 0 -1.0 mg/L的培养基中，培养于光照培养室内，培养温度为25±1℃，每光照培养14 h后转入黑暗中培养10 h，光照强度30-40 μmol/(m·s)。

6.根据权利要求5所述的一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：在所述步骤（2）的培养基为Nitsch+ TDZ 0.6 mg/L +6-BA 2.0 mg/L+PVP 1.0 mg/L+LH 0.5 mg/L。