[发明专利]一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法

说明书

技术领域

    本发明属于植物培养技术领域，具体涉及山腊梅的快速繁殖方法。

背景技术

    山蜡梅（Chimonanthus nitens Oliv.），又名臭蜡梅、秋蜡梅、亮叶蜡梅、野蜡梅等，为蜡梅科蜡梅属常绿灌木，产于安徽、浙江、江苏、江西、福建、湖北、湖南、广西、云南、贵州和陕西等省区。叶入药，名山蜡梅，异名香风茶、毛山茶、岩马桑，其性温，味辛、微苦，具祛风解表，芳香化湿之功效，主治流感、中暑、慢性支气管炎、湿困胸闷和蚊蚁叮咬等症。山蜡梅叶具有浓郁的香味，其精油成分不仅具有镇痛、镇咳、祛痰作用，还能抑制食欲，明显减缓小鼠的体重增长。临床上利用山蜡梅茶流感患者具显著疗效，尤其对由感冒引起的发烧畏寒、眼结膜充血疗效最为显著。山蜡梅中因含有烯烃类化学成分，如石竹烯、大根香叶烯等，可广泛用于香料、食品工业、药物合成中间体等；挥发性醇类化合物具有令人兴奋的、调和性的玫瑰花香气味，而且具有抗腐败、抗滤过性病毒等特性，如芳樟醇、香叶醇和橙花叔醇等，而雪松醇则具有柏木香气。山蜡梅叶挥发油中含大量桉叶油，广泛用于重要的香精香料、食品添加剂、化妆品、医药等。此外，山蜡梅解毒汤能治疗单纯疱疹性角膜炎，目前临床上已开发出山蜡梅止咳露、山蜡梅滴丸等产品。此外，因为花期为9～12 月，故山蜡梅也是优美的常绿观赏灌木和具有观赏价值的秋季观花植物。山蜡梅的繁殖可以通过嫁接、压条、扦插和种子等传统繁殖方法，但显然组织培养对于其快速繁殖、引种和优良性状的保持具有不可忽视的作用。蜡梅属仅3种植物，且为我国特产。目前仅有蜡梅（C. praecox）有少量报道，外植体主要采用的是茎段或茎尖，极少数采用子叶和胚，走的是器官发生途径，或先产生愈伤组织再分化，或出芽增殖；基本培养发基主要采用的是MS、改良MS和1/2MS，诱导愈伤组织和分化采用的是6-BA+KT+2，4-D或6-BA+KT+NAA组合，茎段或茎尖的初代培养主要采用的是6-BA+NAA或6-BA+IBA组合，增殖采用的是6-BA+NAA的组合，生根采用的是IBA、NAA或两者的组合。但是总体而言，蜡梅组织培养存在着容易褐化、玻璃化和生根困难等问题。

发明内容

    本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种生根快、玻璃化、褐化率低，成活率高的山蜡梅快速繁殖方法

为实现本发明之目的，采用以下技术方案予以实现：一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法，依次包括以下步骤：

（1）无菌苗的获得：取成熟的山蜡梅果实，剥出其长圆形的瘦果，用手术剪将瘦果两端各剪去少许，剥出带完整种皮的种子，在超净工作台中将其浸泡于质量分数0.2% 的HgCl₂溶液内消毒17-40 min，取出后无菌水浸泡冲洗3次，每次5 min；接种于添加了GA₃ 0.1 mg/L +6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2mg/L的Nitsch基本培养基中。此培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L， pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；在黑暗中培养7 d后，转入光照培养，培养温度为25±1℃；每光照培养14 h后转入黑暗中培养10 h，光照强度30-40 μmol/(m²·s)；种子萌发后，待两片子叶展开并变绿时可取子叶作为外植体，或待芽长出后取无菌苗的茎段作为外植体；

（2）愈伤组织的诱导和不定芽的诱导：

将子叶切下，用解剖刀分成1 cm²左右大小的小块，接种于添加了TDZ 0.1-2.0 mg/L+NAA 0-2.0 mg/L+PVP 0-5.0 mg/L+LH 0-1.0 mg/L的Nitsch基本培养基中，培养于光照培养室内，每光照培养14 h后转入黑暗中培养10 h，光照强度30-40 μmol/(m²·s)； 

（3）不定芽的增殖和壮苗：

将分化出的芽从愈伤组织上切下, 转入增殖培养基Nitsch+TDZ 0-2.0 mg/L+6-BA 0-5.0 mg/L+CH 0-5.0 mg/L+ PVP 1.0 mg/L进行增殖培养；

（4）无根苗的生根：

待不定芽生长3-4 cm高时，切取健壮的不定芽，接种于生根培养基12.5-100%Nitsch+IAA 0-1.0 mg/L +NAA0-0.5 mg/L+AC 0-2.0 mg/L+ CH 2.0 mg/L中；

（5）组培再生植株的炼苗和移栽：