[发明专利]植物耐低温基因AtLCBK1的应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及植物耐低温基因AtLCBK1的应用。 

背景技术

与动物或微生物相比，植物由于其生长的固着性，对环境的要求比较高。作为重要的环境胁迫之一，温度不仅能影响植物的生长发育，同时也是限制作物产量的因素，很多农作物的大量减产就是由于低温寒害造成的，从而给农业生产带来巨大损失，也加剧了全球的粮食危机。因此研究植物响应低温胁迫的生理生化反应及其分子生物学机制，能够为提高植物抵抗低温寒害的能力创造条件，在农业生产中具有重要的实际应用价值。 

最近几十年来，由于科学技术的不断进步，各种植物基因组测序的陆续完成，大量突变体的筛选克隆，相关遗传和生化的分析，都使人们对植物冷适应的分子生物学机制有了一定程度的了解。 

拟南芥属于十字花科植物，由于其形态个体小，生长周期快，基因组小，重复序列少，并且全部基因组测序已经完成，且容易被人工诱变产生大量不同基因位点遗传变异的突变植株，作为一种典型的模式植物，广泛应用于植物遗传、发育和分子生物学的研究。 

发明内容

本发明的目的是提供植物耐低温基因AtLCBK1的应用。 

为了实现本发明目的，本发明提供的植物耐低温基因AtLCBK1的应用，其是通过在植物中过表达AtLCBK1基因，获得耐低温的转基因植物。 

本发明中涉及的AtLCBK1基因的序列为： 

i)Seq ID No.1所示的核苷酸序列；或 

ii)Seq ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或 

iii)在严格条件下与Seq ID No.1所示序列杂交的核苷酸序列； 

所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。 

AtLCBK1基因由4878个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第626位到第4545位碱基。AtLCBK1基因来源于哥伦比亚生态型的拟南芥，在拟南芥基因组数据库中编号为At5g23450。 

由AtLCBK1基因编码的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如，将第189位Arg替换为Val。 

应理解，考虑到密码子的简并性及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。 

本发明还提供含有植物耐低温的AtLCBK1基因序列或其片段的克隆载体或各类表达载体，含有所述载体的宿主细胞，含有所述基因序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。 

前述应用中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物，例如拟南芥等。将植物耐低温AtLCBK1基因在植物中过表达，包括利用任一种可以引导外源基因在植物中过表达的载体进行。 

本发明还提供一种构建耐低温的转基因拟南芥的方法，包括以下步骤： 

1)提取拟南芥总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增AtLCBK1基因，将扩增产物构建到表达载体pSuper1300上，获得的重组表达载体命名为AtLCBK1-pSuper1300； 

2)用AtLCBK1-pSuper1300转化农杆菌GV3101，然后利用转化 的农杆菌侵染拟南芥花序，获得耐低温的转基因拟南芥幼苗。 

其中，步骤1)中所述引物F和R的核苷酸序列如Seq ID No.3和4所示。所述拟南芥优选为野生型拟南芥植株，即具有纯合基因型的拟南芥植株。 

将本发明的AtLCBK1基因过表达后，拟南芥表现为耐低温的表型。为了便于对转基因拟南芥植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物等。 

本发明通过对编码植物内鞘氨醇激酶的基因AtLCBK1(全称为Sphingoid Long-Chain Bases Kinase1)的研究，发现该基因的突变体具有低温敏感的相关表型，而过表达该基因的转基因植株能够产生抗低温的相关表型，本发明首次发现该基因抗低温的重要功能。 

本发明的有益效果在于：