[发明专利]一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法

权利要求书

1.一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于依次包括以下步骤：

（1）老鸦柿外植体的选择和消毒：取4-10月的老鸦柿新抽出的枝条，根据各枝条的木质化的程度将它们分为轻度、中度和高度的茎段；将这些枝条切成带腋芽的茎段，先用刷子于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次后，转入5%的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，无菌水冲洗3次，后转入滴加了2滴吐温-20的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒13-14 min，用无菌水冲洗3次，以正常的极性方向接种到添加有GA₃ 0.1 mg/L，TDZ 0.5 mg/L，6-BA 1.0 mg/L的Nitsch培养基中，此培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L， pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)；

（2）丛生芽的诱导

取7-8月中度木质化的新梢茎段，于冰箱内4℃处理2 h，先用牙刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次后，转入5%的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，无菌水冲洗3次，后转入滴加了2滴吐温-20的0.2% HgCl₂溶液内浸泡消毒8-9 min，用无菌水冲洗3次，以正常的极性方向接种到添加GA₃ 0.1-0.5 mg/L，TDZ 0.1-2.0 mg/L，6-BA 0-3.0 mg/L，叶酸0-2.0 mg/L，CH 0-0.5 mg/L，PVP 0-2.0 g/L 的Nitsch培养基内；培养基中蔗糖浓度为3％，琼脂浓度为0.7％，pH 5.8-6.0，121℃下高温高压灭菌20 min，培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)；

（3）不定芽的增殖

将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有6-BA 0-3.0 mg/L，IBA 0-5.0 mg/L，叶酸0-2.0 mg/L ，CH 0-0.5 mg/L，PVP 1.0-2.0 g/L的Nitsch培养基中；

（4）再生植株的生根培养

切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到12.5%-100% Nitsch，NAA 0-1.0 mg/L ，IBA 0-2.0 mg/L，AC 0-2.0 mg/，椰子汁 0-300 g/L的生根培养基中；

（5）再生植株的炼苗和移栽

待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，扣上瓶盖，12 h后挪开一半瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d；然后将培养基捣碎，拿出再生植株，用水将残留的琼脂洗净，将植株定植于珍珠岩、泥炭的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在24-28℃之间；待新叶长出，即可揭开薄膜并叶面喷雾保持湿润，适应3-5 d后即可移栽大田中。

2. 根据权利要求1所述的一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：在步骤（2）中的Nitsch培养基内添加有GA3 0.2 mg/L，TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L，叶酸1.0 mg/L，CH 0.2 mg/L，PVP 1.0 g/L。

3. 根据权利要求1所述的一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：在步骤（3）中的Nitsch培养基内添加有6-BA 1.0 mg/L ， IBA 0.5 mg/L，叶酸1.0 mg/L，CH 0.2 mg/L，PVP 1.0 g/L。

4. 根据权利要求1所述的一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：在步骤（4）中的Nitsch培养基内添加有25% Nitsch，NAA 0.1 ，IBA 0.5 mg/L， AC 0.5 g/L，椰子汁 50-100 g/L。

5. 根据权利要求1至4任一项所述的一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：步骤（5）中混合基质的珍珠岩、泥炭重量配比为：1：5。