[发明专利]一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法

说明书

技术领域

    本发明属于植物培养技术领域，具体涉及一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法。

背景技术

老鸦柿( Diospyros rhombifolia Hemsl.)，别名山柿子、野山柿、野柿子、糯米饭刺、苦李等，为柿树科柿属落叶小乔木或灌木，分布于安徽、浙江、福建和广东。根或枝入药，又名牛奶柿、丁香柿、月月有、枝柿、丁季李、拳李、糯米饭刺。其性平，味苦涩，具清湿热、利肝胆、活血化瘀之功效，主治肝硬化、急性黄疸型传染性肝炎、骨结核和跌打损伤。其果实可提取柿漆，供涂漆鱼网、雨具等用。实生苗可作柿树的砧木。由于成熟果实桔红色，且可挂果很久，观赏价值高，台湾、韩国、日本等地引种商品化后也有称之为老爷柿、老鸭柿、姬柿等。目前老鸦柿的繁殖采用种子繁殖，存在着繁殖系数低、繁殖周期长的缺点，因此建立老鸦柿的组培快繁体系，是实现其产业化生产的又一有效途径。

目前对于柿科柿属开展的组织培养都是针对于不同品种的柿树(Diospyros kaki)展开的，老鸦柿的组织培养还没有人报道。且大部分柿树组培研究结果表明1/2MS 培养基和1/2( NH₄NO₃， KNO₃) 的改良MS 培养基最适合柿使用。在柿组织培养中, 常用的外植体为芽, 有些报道中也提到用嫩枝梢尖、茎段和幼叶。外植体类型对培养效果的影响是存在品种差异性。Burch 等以平核无的芽、茎段和顶端分生组织( 0.5-1 mm) 为外植体进行培养时, 发现三者形成的有效新梢率存在明显差异，其中芽的为62%，茎段只有10%，而顶端分生组织则不能成活。Fukui等对西村早生梢尖的采集时期进行了研究, 结果表明6 月份为梢尖外植体的最佳采集期, 其新梢的增殖生长以及叶分化情况都明显好于其它月份。大部分报道均认为ZT ( 玉米素) 对促进柿外植体的生长分化效果最好，对于新梢的伸长生长起着不可缺少的作用。关于生长素在生根培养中的作用效果，一些相关报道的结论存在一定差异。个别资料表明生长素对柿组培苗的生根并不是必需的。如Burch等对平核无进行生根培养时发现生长素的有无并不重要, 而培养基中是否含有活性炭( AC) 才是生根的关键。大部分资料的结论却与此相反。有研究表明，生长素的最佳使用类型及浓度为：直接加入培养基中1 mg/L IAA；柿是含酚类物质较多的植物, 因此在离体繁殖过程中容易产生褐变现象。研究表明，配合使用ZT 和IAA、使用PVP等措施可减轻褐化，但也有PVP效果不明显的报道。

发明内容

    本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种成活率高，利于实现产业化生产的老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法。

为实现本发明之目的，采用以下技术方案予以实现：一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法，依次包括以下步骤：

（1）老鸦柿外植体的选择和消毒：取4-10月的老鸦柿新抽出的枝条，根据各枝条的木质化的程度将它们分为轻度、中度和高度的茎段；将这些枝条切成带腋芽的茎段，先用刷子于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次后，转入5%的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，无菌水冲洗3次，后转入滴加了2滴吐温-20的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒13-14 min，用无菌水冲洗3次，以正常的极性方向接种到添加有GA₃ 0.1 mg/L，TDZ 0.5 mg/L，6-BA 1.0 mg/L的Nitsch培养基中，此培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L， pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min。培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)；

（2）丛生芽的诱导