[发明专利]一种甲氧苄啶半抗原化合物T1制备完全抗原的方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲氧苄啶半抗原化合物T1制备完全抗原的方法和应用，属于生物化工技术领域。

背景技术

三甲氧苄胺嘧啶（Trimethoprim，TMP），又名甲氧苄啶，和二甲氧苄胺嘧啶（Diaveridine，DVD）都是一种二氨基嘧啶类的二氢叶酸还原酶抑制剂，白色结晶型粉末，不溶于水，微溶于氯仿、乙醇、丙酮，但易溶于冰乙酸等有机酸。本身抗菌能力较弱，因此常不单独使用，但与磺胺类、呋喃类、喹诺酮类等抗生素联合使用，可大幅度增强抗生素的应用效果，可治疗鸡白痢、禽霍乱、细菌性感染等畜禽疾病。但抗生素和协同增效剂的过度使用和不合理用药，使药物过量残留于动物性食物中，从而对人体健康造成危害。我国农业部和欧盟、日本等都对TMP 在动物组织中的最大残留限量值（MRL）做出了规定，其中我国规定 TMP 的标志性残留物是其本身，其在畜禽肌肉、肝肾、脂肪以及鱼肉、皮等组织中的MRL值为 50μg/kg，欧盟明确规定其不能用于蛋类，日本规定其在鱼类、鸡组织中的 MRL 值为 50μg/kg。 

TMP和DVD的结构式如下：

目前我国对TMP的检测方法主要有气相色谱法（LC）、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法（LC/MS）、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金试纸条法等，并且主要集中在HPLC和LC/MS等仪器分析方法上。尽管仪器方法是TMP检测的确证方法，但存在样品制备复杂、操作繁琐、对操作人员素质要求较高、样本前处理时间太长等缺点，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本的快速筛查及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。

免疫分析方法的关键在于合适的特异性抗原和抗体的获得。由于存在活性氨基基团，传统的TMP人工抗原的合成一般通过EDC法、重氮化法直接与TMP分子上的氨基偶联，再偶联载体蛋白。但由于TMP上有不止一个氨基，都能参与反应，因此得到的偶联物是一个混合物，最终通过免疫动物得到的抗体是针对这种混合物的，抗体的特异性和灵敏度会受到很大影响。而且，由于TMP结构中氨基与嘧啶核直接相连，空间位阻显著将导致免疫效果较差，所制备的抗体灵敏度不理想。

本发明的甲氧苄啶半抗原是利用嘧啶核一端的氨基衍生出活性羧基，经过纯化得到单一特异性结构的甲氧苄啶羧基衍生物（TMP-HS），该衍生物为甲氧苄啶半抗原，将甲氧苄啶半抗原与载体蛋白偶联最后形成甲氧苄啶完全抗原。

发明内容

本发明的目的是针对现有甲氧苄啶检测技术及抗原合成、相应抗体制备的不足和缺陷，提供一种甲氧苄啶半抗原化合物T1制备甲氧苄啶完全抗原的方法和应用。

本发明的技术方案，一种甲氧苄啶半抗原化合物T1的制备方法，

甲氧苄啶半抗原化合物T1结构简式如下：

制备步骤为：在100mL的三颈瓶中依次加入 10mL吡啶、2g丁二酸酐、5mg 4-二甲氨基吡啶，60℃水浴加热磁力搅拌至溶液澄清；以 10mL 吡啶溶解2.9g甲氧苄啶并滴加到所述三颈瓶中，继续搅拌反应3天；采用薄层色谱法，以甲醇︰三氯甲烷体积比为1︰5作为展开剂监控反应进程；减压0.090MPa、50℃蒸馏10min将溶剂全部蒸走，得到淡黄色油状物；继续滴加质量体积比为10%的NaHCO₃水溶液至不再产生浑浊，过滤并调节上清液在pH5.0酸性条件下重结晶析出白色固体，6000 r/min离心10min，滤饼50℃烘干即得产品甲氧苄啶半抗原化合物T1。

用所述甲氧苄啶半抗原化合物T1制备甲氧苄啶完全抗原的方法，将甲氧苄啶半抗原化合物T1与载体蛋白偶联后制备得到甲氧苄啶完全抗原。

所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH或人血清白蛋白HAS中的一种。

当载体蛋白为BSA时，具体步骤为：

（1）甲氧苄啶半抗原化合物T1的活化：将甲氧苄啶半抗原化合物T1用DMF溶解，按甲氧苄啶半抗原化合物T1︰三正丁胺︰氯甲酸异丁酯的摩尔比为1︰1.2︰1.2比例添加反应物，0℃反应1h，得到活化的甲氧苄啶半抗原化合物T1溶液；