[发明专利]一种罗伊乳酸杆菌的电转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种乳酸杆菌的转化方法，具体的说是罗伊乳酸杆菌电转化重组质粒pLEM415-cel15的方法。

背景技术

罗伊乳酸杆菌（L. reuteri）是动物的肠道益生菌，可作为微生态制剂广泛应用于动物饲料中，益生作用主要表现为调节胃肠道微生物区系平衡，提高机体的免疫力和抵抗力，促进机体生长。鉴于乳酸杆菌作为益生菌的广泛应用及其自身的肠道定植能力，近年来许多研究将乳酸杆菌作为基因工程的宿主细胞进行研究。然而，像其他革兰氏阳性细菌一样，乳酸杆菌细胞壁上存在肽聚糖层，细胞壁较厚，不利于电转化时外源DNA进入胞内，严重制约着乳酸杆菌的转化。随着众多电转仪的研发生产和应用，电击转化是一种操作简单且转化效率较高的转基因技术。1984年Harlander和Mckay成功电击转化链球菌后，研究人员开始探索乳酸菌的电击转化条件，并将电击转化成功应用于乳酸杆菌、乳酸球菌和其他乳酸菌。电转化效率的高低具有很高的菌株依赖性，即使同种属的不同菌株应用同一转化条件进行转化，转化效率也存在很大差异。目前，罗伊乳酸杆菌阳性克隆的得率较低，极大的影响了乳酸杆菌基因工程进展的效率。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种罗伊乳酸杆菌电转化的方法，其能将质粒载体pLEM415-cel15高效转化入罗伊乳酸杆菌， 转化效率可提高10倍，可提高后期重组质粒的得率以及基因工程操作的成功率。

一种罗伊乳酸杆菌电转化的方法，包括以下步骤：

步骤一、罗伊乳酸杆菌感受态细胞制备

（1）、在MRS固体培养基划线复苏罗伊乳酸杆菌，挑取罗伊乳酸杆菌单菌落接种至5 mL的 MRS液体培养基中，置于37℃下过夜培养，得到种子液；将种子液接种到50的 mL MRS液体培养基中，接种量为MRS液体培养基体积的10%，然后置于37℃静置培养，当OD值达到1.0时，取出进行冰浴10 min，然后4℃、6 000 r/min离心15 min，弃上清，收集菌体细胞；

（2）、对所收集的菌体细胞进行洗涤，洗涤方法为：先用10mmol/L的MgCl₂水溶液，再用蔗糖甘油混合溶液洗涤，最后用体积浓度为10%的甘油水溶液洗涤；洗涤结束后加入体积浓度为10%的甘油水溶液，吹打使菌体细胞悬浮，即制备出罗伊乳酸杆菌感受态细胞，分装，置于-80℃保存，备用；

所述蔗糖甘油混合溶液为，体积比为1:1的0.5 mol/L蔗糖水溶液和体积浓度为10%的甘油水溶液的混合物；  

步骤二、将所制备的罗伊乳酸杆菌感受态细胞从-80℃取出，置于冰上解冻5 min，加入2μL浓度为0.2μg/μL的质粒载体pLEM415-cel15，混匀后将所得混合物转移至预冷的电击杯中，冰浴5 min，轻震电击杯使混合物进入电击杯底部；然后在电阻200Ω、电容25μF、电压1.5 kv/mm的条件下，电击转化感受态细胞，之后将混合物转移到1000μL MRS液体培养基中，置于37℃复苏培养2 h后，涂布于含红霉素的MRS固体培养基上培养24-48 h；

步骤三、 从含红霉素的MRS固体培养基上随机挑取单菌落，扩大培养后，提取质粒，并做PCR鉴定阳性克隆；同时进行菌落计数，并计算转化效率。电转化效率（CFU/μg DNA）=稀释倍数×菌落数/质粒DNA质量。

所述MRS液体培养基，每升培养基中含有蛋白胨10.0 g、牛肉膏 10.0 g 、酵母膏 5.0 g 、柠檬酸氢二铵[（NH₄）₂HC₆H5O₇] 2.0 g、 葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O) 20.0 g 、1.0 mL吐温80、乙酸钠（CH₃COONa·3H₂O）5.0g、磷酸氢二钾（K₂HPO₄·3H₂O）2.0 g 、硫酸镁（MgSO₄·7H₂O） 0.58 g 、硫酸锰（MnSO₄·H₂O）0.25 g，余量为水；pH值为6.2-6.6。