[发明专利]一种乙型肝炎病毒耐药性和基因型的检测试剂盒与检测方法

说明书

本发明公开了一种乙型肝炎病毒耐药性和基因型的检测试剂盒与检测方法。该试剂盒是基于基因芯片使用的，共包含三组引物。检测时使用三组引物分别对待测样品进行多重不对称PCR扩增，将三种PCR扩增产物混合后与杂交缓冲液混合，制成杂交液；再将杂交液与基因芯片上的探针进行杂交；最后通过PCR产物中的荧光信号来判定所述待测样品的突变型和基因型。检测结果表明：该试剂盒特异性强，灵敏度高，可以同时检测出待测样品的7种突变型和3种基因型，7种突变型包括180M型、181T型、181V型、204I型、204V型、236T型、1896A型，3种基因型包括HBV/B型、HBV/C型、HBV/D型。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒耐药性和基因型的检测试剂盒与检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒是嗜肝DNA病毒，是引起急、慢性肝炎的主要病原之一，并可导致肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。我国是乙型肝炎的高发国家，2009年卫生部公报显示2008年乙肝发病率为106.54/10万人，发病人数为141万例。HBV感染威胁国民健康，HBV的及早诊断和正确治疗应该受到极大关注。

干扰素、拉米夫定、替比夫定、阿德福韦和即将上市的替诺福韦均为国内抗病毒的一线药物，随着抗病毒治疗药物的广泛应用，同时HBV逆转录酶缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，HBV重要位点的基因突变可导致氨基酸侧链的柔性减低，并在HBV的DNA聚合酶和核苷类似物三磷酸盐之间形成空间位阻，与核苷类似物三磷酸盐的结合力下降，从而导致核苷类似物抗病毒药物的耐药发生。目前已发现的HBV耐药变异位点主要集中在P基因的Pol/RT区域，该区域由344个氨基酸编码序列组成，常见的耐药突变类型包括rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtM204I、rtM204V和rtN236T等。干扰素的治疗与1896G→A位点突变有关，但是1896位点突变是否发生干扰素耐药，目前还存在一定争议。

同一病毒核苷酸序列的差异，表现为HBV不同的基因型。迄今为止，根据HBV全基因核苷酸序列的异质性≥8％或S区基因序列差异≥4％，将HBV分为A～H八种基因型。在我国内地主要流行B、C和D3种HBV基因型，所占比例分别为32.06％、67.38％和0.56％。HBV导致的肝癌中，B基因型比C基因型发生单一肿瘤者多，同时伴随更多的卫星病灶，HBV/C基因型携带者大多有慢性肝病，HBV/D基因型感染者多无症状且HBeAg血清转换较早。

近年来，HBV耐药性问题日趋严重，对其耐药性检测在乙型肝炎的治疗中有着举足轻重的作用。同时对HBV感染者进行基因分型检测，明确其基因型，进一步揭示基因型与病情进展与转归的关系，可为临床医生提供更明确的病因诊断，从而拟定抗病毒治疗方案。对乙型肝炎病毒的分型情况和与用药相关情况进行定性检测，以辅助临床诊断，也可用于流行病学调查等领域。寻找一种简便、快速、准确的检测耐药和分型的方法成为许多乙肝科研工作者的重大课题，也是临床实践检验中急待解决的问题。

目前用于HBV耐药和分型的分子检测方法主要有：测序法、限制性片段长度多态性分析法(RFLP)、实时荧光定量PCR方法、线性探针反向杂交法、PCR-基因芯片法等。⑴测序法是HBV基因检测的金标准，准确率高，但灵敏度较低、混合基因型检测能力差(需要筛选大量克隆)，需要测序仪及昂贵的试剂，不适用于临床检测；⑵RFLP方法不需要复杂设备、试剂，但目前方法标准化程度差；⑶定量PCR方法灵敏度高，但通量低，难以检测多基因位点变异；⑷线性探针反向杂交法(INNO-LiPA)扩展性差、肉眼判读容易误判，检测成本高(进口商业试剂盒)，难以在国内临床实验室常规开展。

目前临床需要高通量、高特异性、操作简单，结果判断能自动化的检测方法，因此，研发快速灵敏的乙肝实验室耐药和分型检测技术，存在着巨大的市场需求。基于基因检测的生物芯片技术是近几年发展起来的进行大规模遗传多态性位点检测的新方法，是物理学、微电子学与生命科学等学科的交叉结合，该技术以其分析速度快、可多指标并行检测、所需试剂及样品量少等优势适应了这一需要，为解决这些问题提供了新的科技手段。