[发明专利]聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法

权利要求书

1.一种聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将表达葡激酶突变体Sak-E80C的工程菌接种于液体培养基中，37℃培养6h后，升温至42℃诱导培养4h，然后，4℃、5000 rpm离心10 分钟收菌，弃上清，用pH=5-6、含有0.01M EDTA和0.01M二硫苏糖醇的0.02M NaAC-HAC缓冲液，悬浮菌体进行超声破碎，破碎后4℃、12000 rpm高速离心20 min，收集上清液；

（2）将上清液pH调至5.6，加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.7×30 cm）中，然后用pH=5-6、含有80-1000mM NaCl和0.01M二硫苏糖醇的10-50mM NaAc-HAc缓冲液进行洗脱，分别收集洗脱组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定突变体葡激酶Sak-E80C所在的洗脱峰，从而确定含Sak-E80C的收集液；

将含Sak-E80C的收集液加入到Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）中，上样量为凝胶体积的5%，然后用pH=5-6、含0.01M二硫苏糖醇的10-50mM NaAc-HAc缓冲液进行冲洗，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含Sak-E80C的收集液；

（3）用Bradford 法测定收集液中Sak-E80C的浓度，然后按照摩尔比，Sak-E80C：羟基-马来酰亚胺聚乙二醇 =1:（3-10），在室温下，反应进行3-5小时，修饰完成后，用SDS-PAGE电泳和SEC-HPLC分析聚乙二醇-葡激酶偶联物(HO-PEG-MAL-Sak-E80C；Sak-E80C-HPG)的产率；

将修饰反应液加入SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.6×25 cm）中，然后用pH=5-6、含有100-200mM NaCl 的10-50mM NaAc-HAc缓冲液进行洗脱，收集相应组分；

    将SP-Sepharose FF阳离子交换层析获得的收集液加入到 Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱（2.6×100 cm）中，上样量为凝胶体积的5%，然后用pH=8-9、10-50mM Tris-HCl缓冲液进行冲洗, 分别收集两个主要洗脱峰，用SDS-PAGE电泳显示，其中一个洗脱峰主要成分为聚乙二醇-葡激酶偶联物（HO-PEG-MAL- Sak-E80C-HPG；Sak-E80C-HPG），另一洗脱峰主要为未被修饰的Sak-E80C； 

将含有Sak-E80C-HPG的收集液加入到 Q-Sepharose FF阴离子交换层柱（1.5×15 cm）中，然后用pH=8-9、含有100-200mM NaCl 的10-50 mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含有Sak-E80C-HPG的收集液，最后将含有Sak-E80C-HPG的收集液分装，进行冷冻干燥得到产品。