[发明专利]聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法

说明书

技术领域

     本发明涉及一种聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

葡激酶（staphylokinase, Sak）是来源于金黄色葡萄球菌的一种蛋白质。Sak不能直接使纤溶酶原 (Plg) 转变为纤溶酶(plasmin, Plm) , 而是先与纤溶酶原结合形成无活性的 Sak·plg，在少量纤溶酶启动下，形成活性 Sak·plm，后者进一步激活纤溶酶原分子转变为纤溶酶，纤溶酶溶解血栓基质纤维蛋白从而溶解血栓。在血浆中，Sak·plm 很快被 α2-抗纤溶酶抑制，不激活纤溶系统；当有血栓存在时 Sak·plm 与血栓中的纤维蛋白结合，α2-抗纤溶酶对 Sak·plm 复合物的抑制速度会下降100倍。临床研究结果表明，葡激酶与美国治疗急性心肌梗塞的标准溶栓药物阿特普酶有等同的溶栓疗效，且葡激酶激活纤溶酶原的纤维蛋白特异性更强。然而，葡激酶作为一种外源性的蛋白，有较高的免疫原性，且其半衰期较短，存在易被血液中的蛋白酶降解等缺点，因而，限制了葡激酶的临床应用。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种惰性大分子，其水溶性好、不挥发、无味、不带电荷,可以获得多种分子量不同、结构不同的聚合物形式。而且PEG本身免疫原性极弱,通常在PEG修饰物免疫的动物血清中检测不到特异性的抗PEG抗体。当其偶联到药物分子或药物表面时,可以在其修饰的药物周围产生空间屏障,减少药物的酶解,避免在肾脏中被很快滤过。因而，Sak经聚乙二醇修饰后可以克服其免疫原性高、半衰期短、易被肾脏过滤等缺点，使聚乙二醇化葡激酶药物更适于临床应用。目前，已有许多与葡激酶及聚乙二醇-葡激酶偶联物的制备方法相关的专利申请，如《一种制备葡激酶的方法》（专利号：ZL200610157156.6），《一种低热原葡激酶及其制备方法》（专利号：ZL200510022492.5）《一种低免疫原性葡激酶突变体及其制备方法和应用》（专利号：ZL200910075186.6）等。上述专利只涉及到重组葡激酶的基因构建、诱导表达、分离纯化，制得高纯度的葡激酶纯品，而未涉及后续的聚乙二醇修饰及修饰产物的分离纯化。《聚乙二醇-葡激酶偶物及其制备方法和应用》（专利号：ZL99804195.5）提供了以高纯度的葡激酶纯品为原料制备和纯化聚乙二醇-葡激酶偶联物的工艺，该工艺需经过两次冷冻干燥；《一种聚乙二醇化的葡激酶突变体及其制备方法和应用》（专利号:ZL201110102611.3）和《免疫原性降低和/或清除率降低的葡激酶衍生物的鉴定、生产和应用》（专利号：ZL200910075186.6），虽然全面提供了重组葡激酶突变体基因构建、诱导表达、分离纯化以及聚乙二醇-葡激酶突变体的制备和纯化的工艺过程，但聚乙二醇-葡激酶突变体的整体制备和纯化工艺过程繁琐。以上所有聚乙二醇-葡激酶偶联物纯品制备相关专利所提供的工艺路线可以分割成了三个阶段：一，葡激酶或其突变体经过色谱柱层析纯化后冷冻干燥，获得葡激酶或其突变体纯品；二，以葡激酶或其突变体纯品为原料，与修饰剂反应，制备聚乙二醇-葡激酶或其突变体的偶联物；三，通过色谱柱层析纯化出聚乙二醇-葡激酶或其突变体偶联物，冷冻干燥获得纯品。这种工艺路线存在制备工艺繁琐、周期长、生产成本高、可连续化生产程度低等不足。并且，制备工艺均需经过两次冷冻干燥，导致蛋白质变性聚集和活性降低，而蛋白质变性聚集导致蛋白质产品体内免疫原性升高。

发明内容

本发明的目的是提供一种聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法，克服了现有工艺存在的不足。

本发明是使用聚乙二醇修饰剂共价修饰葡激酶突变体（Sak-E80C；80位的谷氨酸突变成半胱氨酸）特定位点来制备聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的，其中，聚乙二醇修饰剂为羟基-马来酰亚胺聚乙二醇(MAL-PEG-OH；Maleimide PEG Hydroxyl),购自北京键凯科技有限公司，其分子量为2000或5000或7500。葡激酶突变体为Sak-E80C，按摩尔比，葡激酶突变体：修饰剂=1:（3-10）。

    具体的，本发明的聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法，包括以下步骤：

（1）将表达葡激酶突变体Sak-E80C的工程菌接种于液体培养基中，37℃培养6h后，升温至42℃诱导培养4h，然后，4℃、5,000 rpm离心10 分钟收菌，弃上清，用含有0.01M EDTA（乙二胺四乙酸）和0.01M二硫苏糖醇的0.02M NaAC-HAC(醋酸钠-醋酸)缓冲液，pH=5-6，悬浮菌体进行超声破碎，破碎后4℃、12,000 rpm高速离心20 min，收集上清液；