[发明专利]一种生产手性苯基丙酸甲酯的方法

说明书

技术领域

本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到酿酒酵母细胞生物还原制备手性医药中间体(?)-(2S,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯的技术。

背景技术

羟基手性酯是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化羰基化合物的不对称还原具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备羟基手性酯的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的羟基手性酯。生物催化制备羟基手性酯具有很好的应用前景。

生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。

生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。

(?)-(2S,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，由于有2个手性中心，使得化学合成较为困难，成本高。本发明将采用生物催化制备(?)-(2S,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯。

发明内容

本发明采用细胞催化制备(?)-(2S,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯，反应式如下：

底物2-苯甲酰-2-丙烯酸甲酯（1）经酿酒酵母催化还原，得到产物(?)-(2S,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯（2）。有多种微生物可以催化还原，经过大量实验筛选，最终确定采用酿酒酵母作为催化剂，因为其催化还原1的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。

许多酿酒酵母都可以进行生物催化还原，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用酿酒酵母菌株为ATCC 201388D-5。

培养介质：

1、　培养液成份：蛋白胨1.5-2 g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡萄糖18-22 g/L，麦芽浸膏25-30 g，硫酸铵0.2-0.25g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L。

2、固体培养基成份： 在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。

酵母细胞制备。酿酒酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至25-26℃，将酿酒酵母ATCC 201388D-5种子液接种至发酵罐，接种比例为8-10％，通气比为0.5-1V/（V分钟），即每分钟通气量为0.5-1倍发酵液体积，25-26℃培养36-40小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。

反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6-0.7，pH为6.8，底物2-苯甲酰-2-丙烯酸甲酯浓度为80-90 g/L，葡萄糖含量为 10-15g/L，木糖8-10 g/L，吐温80含量为15-20g/L，121℃高压灭菌30分钟。冷却至28-29℃时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿酵母细胞使浓度为10-13g/L，通气比为0.1-15V/（V分钟），即每分钟通气量为0.1-0.15倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为60-70小时。反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(?)-(2S,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯，反应转化率94-96％，产品收率92-94％，对映体过量率（ee%）97-98％。