[发明专利]一种含氯(2R,3S)甲基丙酸甲酯的生产方法

说明书

技术领域

 本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到南极假丝酵母细胞生物还原制备手性医药中间体(?)-(2R,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯的技术。

背景技术

羟基手性酯是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化羰基化合物的不对称还原具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备羟基手性酯的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的羟基手性酯。生物催化制备羟基手性酯具有很好的应用前景。

生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。

生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。

(?)-(2R,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，由于有2个手性中心，使得化学合成较为困难，成本高。本发明将采用生物催化制备(?)-(2R,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯。

发明内容

本发明采用南极假丝酵母细胞催化制备(?)-(2R,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯，反应式如下：

底物2-（4-氯苯甲酰)-2-丙烯酸甲酯（1）经南极假丝酵母催化还原，得到产物(?)-(2R,3S)-3-羟基-3-（4-氯苯基）-2-甲基丙酸甲酯（2）。有多种微生物可以催化还原，经过大量实验筛选，最终确定采用酵母作为催化剂，因为其催化还原1的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。

许多南极假丝酵母都可以进行生物催化还原，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用南极假丝酵母菌株为ATCC 28323，其催化还原效果最佳。

培养介质：

1、　培养液成份：葡萄糖18-20 g/L，淀粉13-15g/L,黄豆粉28-29 g/L，酵母浸膏6-7 g/L，吐温80 0.6-0.8 g/L ， KH₂PO₄ 2-2.4 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3-0.4 g/L，豆油20-25 mL/L，麦芽浸膏26-30 g/L。

2、固体培养基成份： 在液体培养基中加入2%的琼脂粉。

酵母细胞制备。南极假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至24-25℃，将酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为9-10％，通气比为1-1.3V/（V分钟），24-25℃培养49-54小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。

由于底物、产物均对酵母细胞有抑制作用，为了减少底物、产物对细胞的抑制，本发明采用棉纱布吸附底物，反应中，当底物被细胞催化还原，浓度降低时，底物从棉纱布溶出，补充反应消耗的底物。同时，产物被棉纱布吸附，减少了其在水中的浓度，从而大幅度降低了底物、产物对细胞的抑制。底物与棉纱布的比率，决定了反应液中底物、产物的浓度，而且，浓度还与反应温度、反应液成份有关。不同细胞对底物、产物的敏感度不同，所以，要进行大量实验，才能确定最佳的底物与棉纱布的比率。实验表明，对于本发明的菌株、反应液成份、反应温度，最佳的底物与棉纱布的比率为0.3-0.32。具体吸附时，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的棉纱布。调节底物与棉纱布用量，使得底物与棉纱布的质量比率为0.3-0.32。所用棉纱布为普通棉纱布，从市场上购买后，切成0.5cmX0.5cm小块，灭菌，无菌保存待用。