[发明专利]构建测序文库的方法及其应用

权利要求书

1.一种构建测序文库的方法，其特征在于，包括：

(a)在双链DNA片段的两端分别连接接头，以便获得连接产物，其中，所述接头包括第一链和第二链，所述第一链和第二链部分匹配并且所述第一链包含第一标签序列，以便所述接头上限定出双链区和两个单链尾部，所述两个单链尾部之一的序列中包含第一标签；

(b)将所述连接产物裂解为单链DNA片段；

(c)利用探针对所述单链DNA片段进行筛选，其中，所述探针特异性识别预定区域，其中，所述预定区域包括下列之一：

(1)MLH1、PDK1、PIGF、ROBO2、IL7R、MSH2、EP300、FYN、ASXL1、CDKN2A、KEAP1、ESR1、AXIN1、BAP1、CHUK、PTCH1、MAP2K1、CTNNA1、CYLD、SRC、XRCC1、GSTP1、ERCC1、MTHFR、SOD2、CBR3、ATIC、MTRR、DPYD、UMPS、TPMT、UGT1A1、MDR1、CDA、CYP19A1及CYP2D6基因的至少之一；

(2)(1)的CDS区域；以及

(3)(2)的上下游至少10bp的区域；

(d)利用第一引物对所述单链DNA片段进行链延伸反应，以便获得链延伸产物，其中，所述第一引物包括第二标签序列，并且所述第一引物适于与所述接头的第一链形成双链结构，只是所述第一标签序列与所述第二标签序列之间存在错配；

(e)对所述链延伸产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，其中，所述扩增采用适于同时扩增所述第一标签序列和所述第二标签序列的引物，所述引物为第二引物和第三引物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双链DNA片段是通过下列步骤获得的：

将核酸样本进行末端修复，以便获得经过修复的核酸样本；以及

在所述核酸样本的5’末端添加碱基A，以便获得两端分别具有粘性末端碱基A的核酸样本，所述两端分别具有粘性末端碱基A的核酸样本构成所述双链DNA片段。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸样本为人基因组DNA的至少一部分或游离核酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述游离核酸是从患者的外周血提取的。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述患者患有癌症，所述癌症为选自下列的至少之一：

膀胱癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、食管癌以及肝癌。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述人基因组DNA的至少一部分是通过对人基因组DNA进行随机打断而获得的。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头具有3’碱基T粘性末端。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链DNA片段是通过将所述连接产物进行变性处理获得的。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针是以芯片的形式提供的。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在存在UDG酶/FPG酶时，进行所述链延伸反应。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一标签序列和所述第二标签序列分别独立地长度为4～10nt。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一标签序列和所述第二标签序列的长度均为8nt。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一标签序列和所述第二标签序列之间存在至少2nt的错配。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头的第一链的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列，所述接头的第二链的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列，所述第一标签的核苷酸序列为SEQ ID NO：3-6中至少之一所示的序列，所述第二标签的核苷酸序列为SEQ ID NO：7-10中至少之一所示的序列，所述第一引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示的序列，所述第二引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示的序列，所述第三引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：13所示的序列。