[发明专利]构建测序文库的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域。具体而言，本发明涉及构建测序文库的方法、测序方法、确定核酸序列的方法、构建测序文库的装置、测序设备以及确定核酸序列的系统。

背景技术

高通量测序日益被关注，但是目前高通量测序用于低频率突变的检测仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，根据本发明的实施例，本发明提出了用于构建测序文库的方法以及检测低频率突变的手段。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种构建测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(a)在双链DNA片段的两端分别连接接头，以便获得连接产物，其中，所述接头包括第一链和第二链，所述第一链和第二链部分匹配并且所述第一链包含第一标签序列，以便所述接头上限定出双链区和两个单链尾部，所述两个单链尾部之一的序列中包含第一标签；(b)将所述连接产物裂解为单链DNA片段；(c)利用探针对所述单链DNA片段进行筛选，其中，所述探针特异性识别预定区域，其中，所述预定区域包括下列之一：(1)表1所示基因的至少之一；(2)(1)的CDS区域；以及(3)(2)的上下游至少10bp的区域；(d)利用第一引物对所述单链DNA片段进行链延伸反应，以便获得链延伸产物，其中，所述第一引物包括第二标签序列，并且所述第一引物适于与所述接头的第一链形成双链结构，只是所述第一标签序列与所述第二标签序列之间存在错配；(e)对所述链延伸产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，其中，所述扩增采用适于同时扩增所述第一标签序列和所述第二标签序列的引物。。

由此，利用根据本发明实施例的构建测序文库的方法，能够有效地构建测序文库，同时，所构建的测序文库中，针对相同的双链DNA片段(在本文中也被称为“源序列”)的每条链，分别获得了具有第一标签序列和第二标签序列的扩增产物，由此，在后续测序结果的分析中，可以依据两种标签的测序结果进行互相校正，提高分析结果的可靠性。

根据本发明的实施例，所述双链DNA片段是通过下列步骤获得的：将核酸样本进行末端修复，以便获得经过修复的核酸样本；以及在所述核酸样本的5’末端添加碱基A，以便获得两端分别具有粘性末端碱基A的核酸样本，所述两端分别具有粘性末端碱基A的核酸样本构成所述双链DNA片段。由此，可以在后续操作中，方便地在所述双链DNA片段的两端添加接头。从而，提高了构建测序文库的效率。

根据本发明的实施例，所述核酸样本为人基因组DNA的至少一部分或游离核酸。根据本发明的实施例，所述人游离核酸是从患者的外周血提取的。根据本发明的实施例，所述患者患有癌症，所述癌症为选自下列的至少之一：膀胱癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、食管癌以及肝癌。由此，利用本发明实施例的方法，能够有效地对人类疾病患者的基因突变进行有效的分析，进而能够有效用于常见肿瘤的早诊、个体化用药、以及术后监控等。

根据本发明的实施例，所述人基因组DNA的至少一部分是通过对人基因组DNA进行随机打断而获得的。由此，可以在后续操作中，方便地在所述双链DNA片段的两端添加接头。从而，提高了构建测序文库的效率。

根据本发明的实施例，所述接头具有3’碱基T粘性末端。由此，可以在后续操作中，方便地在所述双链DNA片段的两端添加接头。从而，提高了构建测序文库的效率。

根据本发明的实施例，所述单链DNA片段是通过将所述连接产物进行变性处理获得的。由此，可以快速有效的获得单链DNA片段。根据本发明的一些实施例，所述变性处理可以为热变性处理或碱变性处理。

根据本发明的实施例，所述探针是以芯片的形式提供的。由此，可以提高探针筛选的效率。

根据本发明的实施例，在存在UDG酶/FPG酶时，进行所述链延伸反应。由此，可以有效地对存在损伤的DNA在链延伸过程中进行修复，减少假阳性的产生，提高构建测序文库的质量。

根据本发明的实施例，所述第一标签序列和所述第二标签序列分别独立地长度为4～10nt。根据本发明的实施例，所述第一标签序列和所述第二标签序列的长度均为8nt。根据本发明的实施例，所述第一标签序列和所述第二标签序列之间存在至少2nt的错配。发明人惊奇地发现，采用如此设置，能够有效地提高在后续分析中，利用第一标签序列和第二标签序列进行校正的效率。