[发明专利]一种用于莱茵衣藻多基因共表达的载体及其构建方法

权利要求书

1.一种用于莱茵衣藻多基因共表达的载体Dh5α/pJD124, 保藏号为：CCTCC M2014394；其特征在于，所述的Dh5α/pJD124，由如下步骤得到：

（1） 以初始载体质粒pH124为模板， BleF和BleR为引物，进行PCR扩增，得到含有博莱霉素抗性基因的DNA片段的博莱霉素抗性基因Ble resistant；

（2） 以初始载体质粒pH124为模板，RBCSTF和RBCSTR为引物，进行PCR扩增，获得终止子Ter；

（3）以启动子Ph5-rb为模板，ProF和ProR为引物，进行PCR扩增，PCR扩增产物经纯化后连入pMD18-T simple载体中，得到中间重组载体，记作pJD1；

（4） 用EcoRI和BamHI酶切载体pJD1，回收载体大片段A；用EcoRI和BamHI酶切终止子Ter，回收302bp片段；将所述载体大片段A与所述302bp片段连接，得到重组载体，记作pJD12；

（5） 用BamHI和NotI酶切载体pJD12，回收载体大片段B；同样用BamHI和NotI酶切博莱霉素抗性基因Ble resistant，回收1170bp片段；将该片段与所述的载体大片段B连接、转化，得到重组载体，记作pJD124，即为目的表达载体Dh5α/pJD124;

共同表达GFP基因和RED基因的载体pJD124-GFP-RED的构建方法如下：

（1）以载体pEGFP-N1为模板，F1和R1为引物扩增GFP基因，扩增产物用PCR产物纯化试剂盒纯化;

（2）用HindIII和EcoRI酶切已纯化的GFP扩增产物，并回收730bp片段；用HindIII和EcoRI酶切载体pJD124，回收大片段；将回收的载体大片段与730bp片段连接、转化，得到重组载体，记作pJD124-GFP;

（3）以载体pDsRed1-N1为模板，F2和R2为引物扩增DsRed基因，扩增产物用PCR产物纯化试剂盒纯化;

（4）用HindIII和EcoRI酶切已纯化的DsRed扩增产物，并回收680bp片段；用HindIII和EcoRI酶切载体pJD124，回收大片段；将回收的载体大片段与680bp片段连接、转化，得到重组载体，记作pJD124-Red;

（5）用BglII和NotI酶切载体pJD124-RED，切胶回收2640bp的DNA片段，同时用NotI和BglII酶切载体pJD124-GFP，切胶回收4300bp的大片段;

（6）将回收的4300bp载体片段与2640bp的DNA片段按照摩尔比1:3的比例混合，再经T4DNA连接酶连接并转化后获得重组载体，记作pJD124-GFP-RED,该载体能够在莱茵衣藻细胞核中同时表达GFP基因和DsRed基因。

2.根据权利要求1所述的载体Dh5α/pJD124，其特征在于，所述的载体Dh5α/pJD124有用于表达外源基因的外源基因表达盒，所述的外源基因表达盒两侧具有两对同尾酶的识别位点。

3.根据权利要求2所述的载体Dh5α/pJD124，其特征在于，所述的两对同尾酶分别为BglII/BamHI和ScaI/StuI。

4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的载体Dh5α/pJD124在莱茵衣藻单基因或多基因共表达研究中的应用。

5.根据权利要求4所述的载体Dh5α/pJD124在莱茵衣藻单基因或多基因共表达研究中的应用，其特征在于：所述的莱茵衣藻为细胞壁缺陷型CC-849。