[发明专利]一种用于莱茵衣藻多基因共表达的载体及其构建方法

说明书

一种用于莱茵衣藻多基因共表达的载体,其构建方法:1. 制备含有博莱霉素抗性基因的DNA片段的博莱霉素抗性基因Ble resistant。2. 制备终止子Ter；3.以启动子Ph5‑rb为模板，扩增产物经纯化后连入pMD18‑T simple载体中，得中间重组载体pJD1；4.酶切载体pJD1，回收载体大片段A；酶切终止子Ter，回收302bp片段；将所述载体大片段A与所述302bp片段连接，得重组载体；5.酶切载体pJD12，回收载体大片段B；酶切博莱霉素抗性基因Ble resistant，回收1170bp片段；将该片段与所述的载体大片段B连接、转化，得到目的表达载体Dh5α/pJD124。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种能在莱茵衣藻中同时表达多个基因的表达载体及其构建方法。

背景技术

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardii )是一种单细胞真核藻，个体直径为5-17微米，有两根鞭毛，一个占细胞总体积近40%的大型杯状叶绿体。莱茵衣藻培养条件简单，能进行光合作用而自养生长，也能同化外来碳源进行异养生长，还可以自养、异养同时进行；其生长速度快，细胞倍增周期为5-6小时，可以在短时间内大量繁殖，因上述特性，使得莱茵衣藻作为藻类研究的模式生物，被广泛地应用于各种研究中。

目前，莱茵衣藻的全基因组序列测序已经完成，其核基因组大小约为100Mb，线状的线粒体基因组大小为15.7kb，环状的叶绿体基因组大小为203.8kb，更重要的是，针对核基因、叶绿体基因和线粒体基因的遗传转化体系已经比较成熟，使莱茵衣藻成为理想的转基因植物受体和生物反应器。已有数种蛋白在莱茵衣藻中成功表达，例如：张中林等将丙型肝炎病毒融合抗原基因NS3-C后在莱茵衣藻叶绿体中成功表达（张中林, 山松, 陈曦等.丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定点整合入衣藻叶绿体基因组的研究, 遗传HEREDITAS(Beijing). 1999; 21: 1-6）；胡章立等将增强型绿色荧光蛋白基因转入莱茵衣藻核基因中，成功实现了该蛋白的稳定表达（胡章立, 王潮岗, 吴锦霞. 增强型绿色荧光蛋白在莱茵衣藻中的高效表达. 深圳特区科技. 2005, 0: 217-222）；李明泽等实现了细胞色素cytb5基因在莱茵衣藻中的活性表达（李明泽, 程奇. 含铁蛋白cyb5融合基因莱茵衣藻核转化表达载体的构建及转化. 中国农学通报, 2013, 30: 4515-4522），因此，开展莱茵衣藻外源基因表达的研究具有重要的应用价值。

但是，莱茵衣藻外源基因表达仍存在问题：一方面外源基因的表达效率不够高，与其它成熟表达宿主（如大肠杆菌、毕赤酵母）相比，其外源基因表达能力远远落后；另一方面，现阶段的表达载体只能完成单个外源基因的表达，对多个基因同时表达的情况无法应对，并且国内外市场上也没有成熟的载体和表达系统能完成上述工作，由此可见，开发新的表达载体和体系十分必要。

发明内容

为克服上述提到的缺点，本发明的目的是提供一种能同时表达多个外源基因的莱茵衣藻表达载体，本发明提供可同时表达多基因的莱茵衣藻表达载体是Dh5α/pJD124，保藏号CCTCC NO: M 2014394，保藏日期为2014.8.30，分类命名和拉丁文学名为大肠杆菌DH5α/pJD124（Escherichia coli DH5α/pJD124），保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址是中国.武汉.武汉大学，邮编是430072，传真（027）68754833，email是cctcc@whu.edu.cn，该培养的存活性于2014.9.5检测完毕，结果为存活。

本发明的另外一个任务是提供这种能同时表达多个外源基因的莱茵衣藻表达载体的构建方法,为实现这个目的，本发明采用的技术方案如下：实现本发明的技术方案是：