[发明专利]基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒。所述方法包括：第一轮扩增、消化引物、第二轮扩增、混合、回收、测序、分析。在本发明中，第一轮扩增采用通用序列+各个基因的特定引物组成的混合物，此时多重扩增起作用的是每个基因的特定序列，每个基因前面都加上了通用序列；第二轮扩增引物采用标签序列+通用序列，此时扩增起作用的是通用序列，最后的产物前面又都加上了可识别的标签序列。通过对每个样本都引入独特的引物标签序列，使样本在第二代高通量测序技术检测时，每个样本的测序结果都可以通过其独特的引物标签序列找回，可以应用于同时检测大量样本的多个不同基因位点，大大降低了测序成本。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及标记和捕获多个样本的特定基因的方法和试剂盒，特别是，涉及基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒。

背景技术

新一代高通量测序仪的出现大大降低了核酸测序成本，其具有高通量、低成本、测序错误率低等特点。应用第二代高通量测序技术，可以对混合的核酸分子进行序列测定，同时分辨和测出每个独立的序列，使得该测序技术在高通量标记开发成为可能。

随着高通量测序技术在人类疾病研究、微生物基因组测序等方面的广泛开展，如何最大限度发挥第二代测序技术的高通量和大数据量等特点，降低单样本测序成本成为下一步测序技术的发展方向，具有很大的市场前景和价值。

然而，常规的PCR-index技术，对于每个PCR产物的index标签都是需要单独进行扩增标记，然后将所有的产物混合测序，当PCR片段较多时，不仅操作繁琐，而且很难控制片段混合的均一性，会导致最终测序结果中片段之间数据量差距巨大。

发明内容

本发明的目的是利用高通量测序技术对大量样本中的特定基因相关序列同时进行测序分析，解决传统方法通量低、测序成本高的问题，扩大第二代测序技术在PCR测序领域的应用。

针对本发明的目的，本发明整合了多重扩增技术和PCR-index技术，提供了一种新型的PCR扩增技术方案，利用PCR反应在PCR产物两端各引入一个引物标签，通过PCR产物两端引入的引物标签可以特异地得到PCR产物的样本信息，同时通过引物标签和扩增引物的组合，能够特异地得到PCR产物对应的样本上的基因信息。

根据本发明的一个方面，提供了一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法，包括以下步骤：

第一轮扩增：使用由通用序列和针对特定基因的扩增引物组成的第一轮扩增引物组合对各样本的一个或多个特定基因进行扩增，以使每个基因的扩增产物的两端上都加上了通用序列，其中，所述通用序列中的正向通用序列与反向通用序列彼此不同；

消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体；

第二轮扩增：使用由标签(index)序列和通用序列组成的第二轮扩增引物对第一轮扩增得到的产物进行扩增，以使扩增产物的两端都加上与其他样本区分的可识别的标签序列；

混合：将各样本的第二轮扩增产物混合在一起；

回收：回收所设计的目标区域范围之间的所有DNA条带；

测序：将回收的DNA混合物进行测序；

分析：基于每个样本独特的标签序列，将获得的测序结果与样本一一对应，以及根据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。

优选地，本发明提供了一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法，包括以下步骤：

1)引物设计：