[发明专利]一种快速提取杉木总RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从植物组织中快速提取总RNA的方法，特别涉及一种从富含多酚等次生代谢产物的植物组织中提取总RNA的方法。 

背景技术

杉木（Cunninghamia lanceolata （Lamb.）Hook.）是我国南方重要的用材林树种。近年来，随着分子生物学技术的发展，国内外也逐渐开始利用分子生物学手段来开展杉木的相关研究，而从杉木组织中提取高质量的总RNA是进行这些研究的基础和关键。 

杉木富含多酚等次生代谢产物，多酚易被氧化成褐色的醌类物质，会使RNA降解，RNase和多酚氧化酶都属于蛋白质，要获得完整的、高质量的总RNA就必须能够去除蛋白，次生代谢产物则易于RNA结合，阻碍RNA的分离。因此，要获得高质量的杉木总RNA，就必须要去除多酚和次生代谢产物，抑制多酚的氧化。 

目前，常见植物材料总RNA的提取方法较多，主要有CTAB法、改良CTAB法、Trizol法、异硫氰酸胍法、热硼酸法等，但尚未有一种能够快速从杉木组织中提取总RNA的方法。我们迫切需要一种成本低廉，操作简单、方便，高效的提取方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、经济、高效的快速提取杉木总RNA的方法，为研究人员在实际工作中提供更多的选择。所提取的RNA质量高，可以满足RT-PCR、Northern杂交等基因分离和表达分析等研究的需要，同时可以大大降低实验的成本。 

本发明所提供的一种快速提取杉木总RNA的方法，包括以下步骤： 

（1）在1.5 ml离心管中混匀如下液体：1 ml SDS提取液和40-60μl 巯基乙醇，记为提取液A； 

（2）取90-120mg新鲜杉木材料放到2 ml离心管中，并加入钢珠，迅速放到液氮中速冻，用高通量组织研磨仪研磨成粉末； 

（3）向研磨后的离心管中迅速加入0.8-1.5 ml提取液A，涡旋混匀，室温静置8-15 min，4℃，13000g离心10-20 min；

（4）吸取500-700μl上清至一新的1.5 ml离心管中，加入200-400μl 5 mol/L NaCl和400-600μl氯仿，混匀，4℃，13000g离心4-7 min；

（5）吸取500-700μl上清，加入等体积的水饱和酚：氯仿v/v=1:1的混合液，混匀，4℃，13000g离心4-7 min；

    （6）吸取300-500μl上清于一新的1.5 ml离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，于室温下在侧摆摇床上摇匀10 min；

    （7）将上述摇匀后的液体吸入到离心柱中，4℃，13000g离心1-3 min；

    （8）加入75%预冷的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000g离心1-3 min；

    （9）重复步骤（8）；

    （10）弃液，4℃，13000g空离心1-3 min；

    （11）更换底部的收集管为新的1.5 ml无RNA酶离心管，向上述离心柱中央加入30-50μl DEPC水，静置2-5 min，4℃，13000g离心1-3 min；

    （12）将离心后离心管底部的液体重新吸入离心柱中，静置2～5 min，4℃，13000g离心1-3 min；

    （13）弃离心柱，将新的收集管-20℃保存备用。

SDS提取液配置：0.25M NaCl，0.05M Tris-HCl、pH=7.5，20mM EDTA、pH=8.0，1%SDS。 

更优选地，一种快速提取杉木总RNA的方法，包括以下步骤： 

（1）在1.5 ml离心管中混匀如下液体：1 mlSDS提取液和50μl 巯基乙醇，记为提取液A； 

（2）取100mg新鲜杉木材料放到2 ml离心管中，并加入2个5 mm钢珠，迅速放到液氮中速冻，用高通量组织研磨仪研磨成粉末； 

（3）向研磨后的离心管中迅速加入1 ml提取液A，涡旋混匀，室温静置10 min，4℃，13000g离心15 min；

（4）吸取600μl上清至一新的1.5 ml离心管中，加入300μl 5 mol/L NaCl和500μl氯仿，混匀，4℃，13000g离心5 min；

（5）吸取600μl上清，加入等体积的水饱和酚：氯仿v/v=1:1的混合液，混匀，4℃，13000g离心5 min；