[发明专利]一种灰葡萄孢菌剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种灰葡萄孢菌剂的制备方法。

背景技术

灰葡萄孢（Botytis cinerea）是常见的葡萄病原真菌，在一般情况下它侵染葡萄植株会引起葡萄灰霉病。但在早晚阴冷湿润、下午干燥炎热的特殊环境下则会引发贵腐作用。贵腐作用是由于葡萄在接近成熟期感染了灰葡萄孢（Botytis cinerea）所引起的，灰葡萄孢的侵染和生长能够使葡萄原料的水分挥发，导致葡萄果实中糖类、有机酸、多元醇等成分发生变化，最终形成含糖量很高且芳香浓郁的贵腐葡萄。由贵腐葡萄酿造而成的贵腐葡萄酒是世界上最高档的甜葡萄酒。

目前制备灰葡萄孢孢子菌种的马铃薯－蔗糖－琼脂培养基或马铃薯－葡萄糖－麦芽汁－琼脂培养基等实验室级产孢子培养基，不但价格昂贵、培养孢子的效果不稳定，且制作使用不方便，不利于大规模生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种廉价高效且易于大规模生产过程操作的灰葡萄孢菌剂的制备方法，满足大规模生产贵腐葡萄过程中对于灰葡萄孢孢子菌种的巨大需求。

本发明的技术方案：一种灰葡萄孢菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1）固态培养基的制备

将葡萄酒酒泥与麸皮按质量比1:0.75-1:1.5混合，控制固态培养基基质的含水量为50%-60%，充分混匀后灭菌，即获得所需固态培养基；

2）接种灰葡萄孢

向固态培养基质中接种液体灰葡萄孢菌种，所述液体灰葡萄孢菌种由原种通过液态发酵获得；

3）固态发酵

将接种后的固态培养基质置于8-15℃条件下进行固态发酵，保持发酵环境空气循环，培养5-14d，至基质长满白色绒毛状的灰葡萄孢菌丝后翻料，将发酵温度升高至18-22℃再培养3-5d，至基质表面布满绿色或灰黑色孢子囊后终止发酵；

4）孢子收集

将发酵所得培养物于45℃风干至含水量小于30%，粉碎后过200目筛，收集灰葡萄孢菌剂。

优选的，所述固态培养基还包括胶体壳聚糖，其添加量为所述基质总质量的0.05%-0.5%；胶体壳聚糖抑制杂菌的生长，促进灰葡萄孢孢子的生长。

优选的，所述胶体壳聚糖的浓度为10g/L-100g/L。

优选的，所述胶体壳聚糖由乙酰度达到75%以上的壳聚糖粉与12mol/L浓盐酸或冰乙酸按质量体积比5：1-5：3混合搅拌酸化后加水稀释获得。

优选的，所述固体培养基的灭菌工艺为：100℃灭菌30min-60min。

优选的，所述液体灰葡萄孢菌种的制备方法如下:

1）种子培养基制备：取质量比为1:1的马铃薯和大麦芽，并粉碎，马铃薯粉碎至直径不大于1cm小块，大麦芽粉碎至粒径20目，加水后于60℃糖化8h，过40目筛除渣，滤液用水稀释至浓度为26%-28%，121℃湿热灭菌20min；

2）菌株选取：所述菌株选自中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏的灰葡萄孢ACCC36257或ACCC36258，或由野生灰葡萄孢菌株筛选得出；

3）液体种子培养：

从所选菌株刮取原种，制备生物量为10⁶-10⁸CFU/mL的原种孢子悬浮液，按体积比4%-10%的量接种于种子培养基中，10℃-20℃条件下发酵1-2d。

优选的，液体种子的发酵方式为振荡发酵或机械搅拌发酵。

本发明具有如下显著的有益效果：

1、本发明利用葡萄酒泥固态发酵生产灰葡萄孢菌剂，将葡萄酒酒泥变废为宝，拓宽的葡萄酒的产业链。

2、利用低温发酵和添加壳聚糖的手段，实现灰葡萄孢在固态基质中形成优势菌群，使菌剂的制备可以在非无菌环境中正常进行，可操作性强，适于大规模工业化生产。

3、制作工艺简单，制作成本大幅度下降，制得的灰葡萄孢菌剂效果稳定，适合推广应用，具有显著的经济效益。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种修改或改动，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：

1）固态培养基的制备