[发明专利]一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码序列与应用

说明书

本发明公开了一种介导大肠炎相关基因Ace2的靶向敲除的转录激活子样效应因子核酸酶，其编码序列及其应用。本发明的转录激活子样效应因子核酸酶含有一对转录激活子样效应因子蛋白及分别与其融合的DNA内切酶的单体或催化亚基，具有分别识别并切割小鼠Ace2基因上的两个相邻位点的功能，从而高效、特异地靶向敲除Ace2基因，从而快速获得小鼠大肠炎模型，为大肠炎的研究提供良好的遗传资源。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码序列与应用。

背景技术

随着后基因组时代的到来，反向遗传学成为人们研究特定基因功能的重要手段。动物疾病模型的建立，是人们用来研究特定疾病的发病机理、药物靶点筛查和药物药性评价的必不可少的工具。其中，小鼠模型具有体型小、饲养管理方便、易于控制、生产繁殖快、使用成本低等优点，一直受到研究者的青睐。目前，小鼠经过长期的人工饲养和选择培育，已育成1000多种近交系和远交系。在如此众多的小鼠品系中，近交系小鼠由于其遗传上的高度一致性，利用近交系小鼠得到的数据往往可比性好、精度高、数据均一、遗传稳定，因此广泛应用于医学研究。相对地，远交系小鼠因其繁殖力强、成活率高，也是生物学研究中重要的实验材料。

近年来，基因打靶技术日益成熟，是研究者定向修饰基因组密码的重要工具，大大简化了细胞水平、生物个体水平的基因功能研究。然而，传统的基因打靶技术依赖细胞内的同源重组过程，其自然发生的几率为百万分之一，导致基因打靶技术的效率低下；而且，打靶载体往往需要设计较长的同源臂，增加了实验的难度；再者，这项技术是建立在干细胞技术之上的，对干细胞技术要求较高。所以，传统的基因打靶技术存在效率低、费时费力、技术要求高等不足，其应用受到了很大的局限。

近年来，新的基因靶向技术——锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)和规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)相继问世，极大地提高了基因编辑的效率。这三种不同的技术有着类似的作用方式，由可设计的蛋白(ZFNs和TALENs)或RNA(CRISPR/Cas9)特异地识别靶位点，引导相应的核酸酶在靶位点对DNA进行剪切，产生DNA双链断裂(DBS)。通常地，断裂的DNA会采用非同源末端连接(NHEJ)的方式对DNA进行修复，而这种修复往往会造成小片段的缺失或者插入，因而导致靶基因的失活；另一种可能是，在有修复模板存在的情况下，DNA的修复会按照模板DNA进行。因此，这些能够很好地应用于基因失活、基因敲入、表观修饰等领域。其中，由于ZFNs的模块性不强，设计一个剪切活性高、特异性好的ZFNs并不容易，且很多基因位点难以找到合适的ZFN靶点，因此大大限制了ZFNs的应用。CRISPR/Cas9技术虽然设计简单，但存在较高脱靶的可能性。相比而言，TALENs具有效率高、特异性强、细胞毒性低等优点，是建立基因敲除模型的理想方法。TALENs自2011年起开始兴起以来，已在家蚕、斑马鱼、小鼠、家畜以及人类细胞上得到了成功的应用，这些成功的案例说明TALENs具有很好的多物种适用性。

大肠炎是一类比较常见的肠道疾病，其发病过程与遗传、环境以及精神压力等因素息息相关，目前其病因尚不完全清楚。因此，开发大肠炎动物模型，具有很好的应用前景。

与大肠炎相关的基因较多。其中，ACE2蛋白通过调节小肠上皮细胞对食物中色氨酸的吸收，进而影响抗菌肽的分泌以及肠道微生物的平衡。一旦ACE2蛋白的功能发生变化，大肠中的微生物平衡会被打破，从而导致大肠验证的发生。

目前，在近交系小鼠中，研究者已经采用传统的基因打靶方法，构建了几个品系的大肠炎小鼠模型，但是其效率低下，很难快速地得到大量的模型小鼠，以满足后续的疾病机理、药物毒理、药效评价等研究。并且，传统的打靶方法会引入标记基因。有研究表明，标记基因可能会对实验结果造成一定的影响，虽然这种说法尚无定论，但在构建模型的时候，应尽量避免标记基因的引入。

因此，一种高效、无标记的模型构建方法需要被开发出来。同时，目前所有的大肠炎研究都集中于近交系小鼠，远交系小鼠模型的构建未见报道。