[发明专利]邻苯二甲酸在氨基酸分析中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及邻苯二甲酸在氨基酸分析中的应用，具体说，是涉及邻苯二甲酸作为流动相添加剂在氨基酸液相色谱－质谱联用分析中的应用，属于氨基酸分析技术领域。

背景技术

氨基酸不仅是生物体内蛋白质的基本组成单元，也是体内合成神经递质、卟啉、多胺等含氮化合物的重要前体。近期的研究表明，氨基酸还在体内起着重要的调控作用，如基因表达过程、蛋白质的磷酸化、荷尔蒙的合成与分泌等。氨基酸在体内的存在形式主要有两种，一种是以游离态存在于生理体液中，如血浆、尿液等之中，另一种是以结合态存在于多肽和蛋白质中。氨基酸作为生物体内代谢循环的重要组成部分，对其定性定量分析在蛋白质化学、生物化学、临床医学等领域的研究中都起着非常重要的作用。

目前氨基酸的分离、分析方法正在不断地拓展和完善中，这些方法包括液相色谱与光学检测器联用技术(LC methods coupled with optical detection)、液相色谱－质谱联用技术(简称：LC-MS)、毛细管电泳－质谱联用技术(简称：CE-MS)、气相色谱－质谱联用技术(简称：GC-MS)、核磁方法(简称：NMR)等(参见H.Kaspar，K.Dettmer，W.Gronwald，P.J.Oefne，Anal.Bioanal.Chem.2009，393，445～452；C.W.Klampfl，W.Buchberger，M.Turner，G.S.Fritz，J.Chromatogr.A.1998，804，349～355.)。

液相色谱－质谱联用方法是氨基酸的重要分析方法之一。由于液相色谱在分离热不稳定和高沸点化合物方面的优势以及质谱超高的灵敏度和强大的鉴定能力，使得LC-MS方法成为分离分析复杂生物样本的有效手段。使用LC-MS方法分析氨基酸还可以进一步分为两类，一类是游离氨基酸的直接分析，主要包括离子对反相色谱－质谱方法(Ion-pair reversed-phase LC-MS)(参见P.Chaimbault，K.Petritis，C.Elfakir，M.Dreux，J.Chromatogr.A.1999，855，191～202.)和亲水相互作用色谱－质谱方法(简称：HILIC-MS)(参见S.Guo，J.A.Duan，D.W.Qian，Y.P.Tang,，Y.F.Qian，D.W.Wu，S.L.Su，E.X.Shang，J.Agric.Food Chem.2013，61，2709～2719.)；另一类是衍生化间接分析法，主要是指柱前化学衍生化结合反相色谱－质谱联用方法(参见K.Guo，C.Ji，L.Li，Anal.Chem.2007，79，8631-8638；W.-C.Yang，H.Mirzaei，X.Liu，F.E.Regnier，Anal.Chem.2006，78，4702～4708.)。

游离氨基酸的直接分析操作简单，所需分析时间短，前处理时引入的误差因素较少，在分析大量、复杂的生物样本时具有较为明显的优势。

亲水相互作用色谱(简称：HILIC)是近年来色谱领域研究的热点之一。它是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱的灵敏度。采用亲水相互作用色谱－质谱联用技术分离氨基酸时，无需对样品进行衍生化，样品经处理后直接进样，结合超高效液相色谱可以在二十分钟内实现多种氨基酸的分离。由于氨基酸为两性化合物，为了有利于其分离和改善峰形，通常需要在流动相中添加较高浓度的甲酸与甲酸铵或醋酸与醋酸铵形成的缓冲溶液，而流动相中较高浓度的缓冲盐会抑制待测物的响应，影响了检测灵敏度。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供邻苯二甲酸作为流动相添加剂在氨基酸液相色谱－质谱联用分析中的应用，以提高氨基酸的检测灵敏度和色谱分离效果。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的邻苯二甲酸在氨基酸分析中的应用，是指在用于氨基酸液相色谱－质谱联用分析的流动相中添加邻苯二甲酸，邻苯二甲酸的添加浓度为0.005～0.1mmol/L，优选为0.08mmol/L。

作为优选方案，所述的流动相由水相和有机相组成，且水相和有机相中均含有甲酸与甲酸铵。

作为进一步优选方案，所述的水相中含有5～10mmol/L的甲酸铵和0.1V％～0.3V％的甲酸，所述的有机相中含有1～5mmol/L的甲酸铵和0.1V％～0.3V％的甲酸。