[发明专利]一种黄瓜受低硝态氮胁迫标记基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种黄瓜受低硝态氮胁迫标记基因锌指同源异型域转录因子CsZHD5及其应用，属于植物生物技术领域。

背景技术

黄瓜是一种重要的世界性蔬菜，在其生产栽培过程中硝态氮肥的施用量是关系到黄瓜产量和品质的重要因素之一，而在实际生产过程中农民往往过量施用硝态氮肥，不仅造成了氮肥的浪费也在一定程度上引起了环境污染、黄瓜果实亚硝酸盐含量超标、农民生产成本增加等一系列问题，这也是我国目前倡导的绿色及无公害蔬菜生产面临的主要问题。要解决这些问题，选育出耐低氮的蔬菜新品种是根本途径，但也是一个相对漫长的过程，而改变传统落后的施肥方式与观念，科学合理施肥则是解决上述问题的直接、快速的方法。那么，要想准确、适时地投入氮肥就需要及时了解黄瓜栽培环境的氮肥条件是否有利于其生长，以方便改善栽培条件，可以有效提高黄瓜氮肥利用率，而不会造成浪费。在此过程中，如何能够快速、准确、科学地对黄瓜栽培的氮肥条件进行鉴定就是一个极其关键的环节。对于此类鉴定方法，目前仅限于对土壤氮素含量进行检测，却忽略了作物本身对氮素种类的喜好以及需求量等问题，这样就具有一定的局限性和不可靠性。因此，一种高效、科学、准确的鉴定作物氮素栽培环境的方法的出现必将为解决上述问题提供关键性作用。最近，东北农业大学黄瓜课题组在对低硝态氮胁迫条件下黄瓜植株的表达谱结果进行分析时，发现一些基因在不同黄瓜品种中能够持续、稳定的上调表达，这为开发一种鉴定黄瓜植株是否受到低氮胁迫的分子方法提供了思路，即一些基因受到低氮胁迫诱导后在不同黄瓜材料中拥有相似的表达模式和表达量，我们认为此类基因可作为黄瓜植株受低硝态氮胁迫诱导的标记基因，即一旦我们以正常氮素条件下的黄瓜植株为对照，检测发现该标记基因在某种栽培条件下的某黄瓜品种中为上调表达，且表达量也与我们鉴定的相似或更高（例如3倍），则表明该黄瓜品种的生长条件受到了低硝态氮胁迫，暗示农民应该增施硝态氮肥，以保证黄瓜的正常发育和生长。利用上述方法，可以在黄瓜生长发育的关键时期（如开花期、结果初期、盛果期等）及时了解黄瓜植株的氮肥施用情况，根据检测结果改善黄瓜的生长条件以确保黄瓜的丰产和质量安全。本发明涉及的黄瓜受低硝态氮胁迫标记基因及其应用对于实现黄瓜安全生产是切实可行的，且鉴定方法快捷、成本低、便于推广和普及，可为黄瓜无公害栽培提供准确的生产信息，也可为其他作物栽培提供技术参考。这样，如果黄瓜耐低氮机制与合理施用氮肥双管齐下，就等于实现了理论与实践相结合的哲学理念，相信对于黄瓜生产质量的改善必将事半功倍。目前，对于黄瓜受低硝态氮肥标记基因的鉴定及其应用在国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述存在的问题提供一种在低硝态氮胁迫条件下生长的黄瓜植株中稳定上调表达的标记基因锌指同源异型域转录因子CsZHD5的序列引物，并利用该引物进行黄瓜植株是否受到低硝态氮胁迫的鉴定方法，采用实时定量基因扩增荧光检测技术（qRT-PCR），对该标记基因在待检测黄瓜植株中的表达量进行检测和分析，进而了解待检测黄瓜植株是否处在正常硝态氮肥的环境中生长，以科学指导农民的田间施肥。

上述目的通过以下技术方案实现：

1. 提供一种在低硝态氮胁迫条件下生长的黄瓜植株中稳定上调表达的标记基因锌指同源异型域转录因子CsZHD5，其核苷酸序列SEQ ID No.1（534 bp）。

2. 针对上述基因的核苷酸序列，进行qRT-PCR引物的设计，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

3. 提取待测黄瓜叶片和对照黄瓜叶片的总RNA，并反转录合成cDNA第一链，以此为模板，以CsEF1α为内参基因（SEQ ID No.4和SEQ ID No.5），进行qRT-PCR鉴定。若标记基因在待测黄瓜叶片中的表达模式为上调表达，且表达量高于3倍及以上，则表明该待测黄瓜叶片受到了低硝态氮肥的胁迫。

有益效果：

1. 本发明通过对黄瓜受低硝态氮胁迫条件下标记基因的表达量进行分析，可快速、准确地对黄瓜的硝态氮肥生长环境进行判断，为改善黄瓜栽培和生长环境提供科学合理的依据，最终提高黄瓜的产量和品质，与我国倡导发展的无公害绿色农业的宗旨相契合。

2. 本发明的黄瓜受低硝态氮胁迫条件下标记基因，普遍存在与黄瓜基因组中，并且可稳定表达，因此可广泛应用于所有黄瓜的栽培品种，具有重要的推广价值。

3. 本发明所需样本少，不会影响黄瓜的生长发育，操作简便、快捷，高效、科学。

4. 本发明技术易于掌握，不受环境条件影响，重复性高。