[发明专利]一对靶向斑马鱼Forkhead box n1基因的Talen识别序列及其mRNA制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及利用基因打靶技术敲除斑马鱼Forkhead box n1基因的方法。 

背景技术

胸腺是T细胞发育成熟的关键中枢器官，可分泌多种胸腺激素及激素类物质。Forkhead Box(Fox)转录因子家族是一组组翼状螺旋/叉头型转录因子家族，在人类中共发现20多种Forkhead基因，该转录因子在胚胎发育中，特别是内胚层发育器官中发挥着关键调控作用Forkhead box n1在哺乳动物中参与了胸腺的形成、发育、成熟和退化各个阶段，人类和小鼠Foxn1基因突变或缺失可以引起胸腺发育严重障碍或缺失(李红然与张连军等,2010)。而对斑马鱼胸腺发育研究中发现，在Foxn1抑制的胚胎中，胸腺原基减少，T细胞的发育受损，揭示Foxn1在斑马鱼胸腺形成的遗传调控网络中的中心作用(Ma and Wang et al.,2012)。 

因此构建Foxn1基因敲除的斑马鱼对进一步阐明胸腺发育、维持机制具有重要意义。 

传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组的效率特别低(低于10^-6)，增加了实际操作的工作量，限制了该项技术的应用。 

利用RNA干扰引起的基因敲除：RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是RNA依赖的基因沉默现象，是双链RNA分子在mRNA水平上诱发的序列特异性的转录后基因表达沉默，dsRNA在Dicer酶的作用下可产生一系列长度为21～22nt的siRNA(small interferenceRNA)，siRNA分子核酸酶以及螺旋酶等结合形 成RNA诱导沉默复合物(RNA－induced silencing complex，RISC)，RISC以ATP依赖的方式催化双链siRNA解旋，利用RISC内部的单链siRNA，通过碱基配对识别与之互补的靶RNA，切割靶RNA，并由RNA酶降解，从而导致目的基因的沉默，因此，通过将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其同源的mRNA，封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除，但RNAi不能作用于所有基因和某些细胞类型，并存在位置效应，临时性和不完全敲除的弊端。因此，RNAi不能完全取代传统的基因敲除技术。 

锌指核酸酶基因打靶技术(Zincfinger nucleases，ZFNs)：该方法的核心设计思想是将2个有特定功能的结构域，即特异性识别模块和功能模块融合，形成具有特定功能的蛋白。单个ZFN的DNA结合结构域一般包含3～6个Cys2－His2锌指蛋白重复单位、能特异性识别1个三联体碱基与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶、以及来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当2个识别位点相距6～8bp距离时，2个单体ZFN相互作用产生酶切功能，并在此特异位点产生1个DNA双链切口(Doublestrands breaks，DSB)，然后利用细胞固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复。 

TALEN(TranscriptionActivator-like(TAL)Effector Nuclease)基因打靶技术:该方法的设计和构建是基于植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)分泌的一种转录激活子样效应因子(Transcriptionactivator-like effector，TALE)可以识别DNA序列的原理。TALE蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核苷酸序列有恒定的对应关系，由34个氨基酸重复序列组成一个单元，重复17～18次，34个氨基酸中的第12和13个氨基酸为重复可变残基(Repeat Variant Diresidue，RVD)对应识别1个目标碱基利用TAL的序列模块，可组装成特异 结合任意DNA序列的模块蛋白。TALE蛋白中的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合，在特异的位点打断目标基因，进而在该位点进行DNA操作。 

与ZFNs相比，TALENs成功解决了常规的ZFNs方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有与ZFNs相等或更好的活性，无基因序列细胞物种限制，试验设计简单准确，成本低，成功率几乎可达100％，毒性低，脱靶情况少，使基因操作变得更加简单方便。因此是构建基因敲除动物模型的首选。 

参考文献