[发明专利]一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含：

用于检测禽流感病毒H4亚型的引物和探针，其序列如下：

H4-F：5’-GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3’（SEQ ID NO.1），

H4-R：5’-CCATTCTGACAAGCCCACAA-3’（SEQ ID NO.2），

H4-P：5’- TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA -3’（SEQ ID NO.3）；

和用于检测禽流感病毒H6亚型的引物和探针，其序列如下：

H6-F：5’- TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA -3’（SEQ ID NO.4），

H6-R：5’- CACTGCATTGAACCATTTGAACA -3’（SEQ ID NO.5），

H6-P：5’- TGATCATGGCAATAGG –MGB-3’（SEQ ID NO.6）；

其中，荧光探针H4-P和H6-P的报告基团不相同。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含10×双色荧光定量PCR buffer，其含有以下成分：500mM Tris-HCl (pH8.0)、50mM MgCl₂、250mM KCl以及15v/v%的DMSO。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含病毒核酸提取液A、病毒核酸提取液B；病毒提取液A每1000ml中含有：异硫氰酸胍480g，0.1M Tris-HCl（pH 6.4）500ml，0.2M EDTA（pH8.0）120ml；病毒提取液B为异丙醇。

4.一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

1）提取待测样品中的总RNA；

2）以得到的总RNA为模板，使用用于检测禽流感病毒H4亚型的引物和探针

H4-F：5’-GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3’（SEQ ID NO.1），

H4-R：5’-CCATTCTGACAAGCCCACAA-3’（SEQ ID NO.2），

H4-P：5’- TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA -3’（SEQ ID NO.3），

和用于检测禽流感病毒H6亚型的引物和探针

H6-F：5’- TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA -3’（SEQ ID NO.4），

H6-R：5’- CACTGCATTGAACCATTTGAACA -3’（SEQ ID NO.5），

H6-P：5’- TGATCATGGCAATAGG -MGB -3’（SEQ ID NO.6）；

进行双色荧光定量PCR检测，其中，荧光探针H4-P和H6-P的报告基团不相同；

3）结果分析：反应结束后，根据荧光Ct值判断待测样品是否为禽流感病毒H4亚型、禽流感病毒H6亚型阳性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：双色荧光定量PCR反应体系总体积为25μl，其组成如下：双色荧光定量PCR Mix 20μl，反转录酶、Taq酶混合液1μl，以及提取的待测样品中的总RNA或者阳性质控品或者阴性质控品4μl；其中，双色荧光定量PCR Mix中含有H4-F、H4-R、H4-P、H6-F、H6-R、H6-P以及10×双色荧光定量PCR buffer、dNTPS。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述10×双色荧光定量PCR buffer含有以下成分：500mM Tris-HCl (pH8.0)、50mM MgCl₂、250mM KCl以及15v/v%的DMSO。