[发明专利]一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

禽流感是由正黏病毒科流感病毒属A型病毒(AIV)引起的一种禽类感染或疾病综合征。禽流感的发病情况取决于病毒的致病性及一级宿主的易感性，也受环境因素、饲养管理条件及并发疾病等因素的影响，可表现为无症状感染、轻度上呼吸道症状、产蛋量下降及急性的致病性死亡。

2008年我国南方活禽市场监测到一株鸭源H4亚型禽流感病毒（H4N2），而从2009年起在中国南方禽流感疫情监测中分离到多株H4亚型禽流感病毒（AIV），目前发现的禽流感H4亚型尚未形成对哺乳动物的全身性感染，但病毒来源复杂，抗原和基因型差异大，若H4亚型禽流感与高致病禽流感发生重组有可能构成巨大的危害。

H6亚型禽流感，在家禽中广泛存在，致病性和传播力都比较低。2013年6月，台湾出现全球首例H6N1患者，虽然只是个案，但表明H6亚型禽流感有潜在的传染人的能力。

由于H4、H6禽流感不具备高致病性，且未出现规模性的哺乳动物感染，目前常规的H4和H6检测方法，还是血清学诊断方法，其中最常用的为血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验，市场上鲜有相应的PCR试剂盒检测产品。血清学诊断方法建立在已发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且由于禽流感病毒具备高度变异性和重组性，很容易出现假阳性和假阴性。使用病毒分离培养的方法进行检测，操作繁琐，耗时长，难以大规模推广。用普通PCR的方法，相比前面所说的方法灵敏度和可操作性都有提升，然而后续的琼脂糖凝胶电泳仍然不够简便，且容易出现非特异扩增和产物污染。

实时RT-PCR（real time RT-PCR，RRT-PCR）又称TaqMan PCR。RRT-PCR检测禽流感快速、敏感、特异，由于其不仅采用了特异性引物，而且采用了特异性探针，使该方法的特异性高于传统PCR，大大减少了非特异性扩增造成的假阳性结果。全封闭反应的荧光RT-PCR技术是通过计算机记录并分析PCR过程中产生的荧光信号，实现了对PCR扩增过程实时监测，无需电泳检测，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染。应用一步法RT-PCR和荧光水解探针，用于检测A型禽流感，其敏感度很高，可达10 fg（约100个）的靶RNA分子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含：

用于检测禽流感病毒H4亚型的引物和探针，其序列如下：

H4-F：5’-GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3’（SEQ ID NO.1），

H4-R：5’-CCATTCTGACAAGCCCACAA-3’（SEQ ID NO.2），

H4-P：5’- TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA -3’（SEQ ID NO.3）；

和用于检测禽流感病毒H6亚型的引物和探针，其序列如下：

H6-F：5’- TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA -3’（SEQ ID NO.4），

H6-R：5’- CACTGCATTGAACCATTTGAACA -3’（SEQ ID NO.5），

H6-P：5’- TGATCATGGCAATAGG –MGB-3’（SEQ ID NO.6）；

其中，荧光探针H4-P和H6-P的报告基团不相同。

优选的，所述试剂盒还包含10×双色荧光定量PCR buffer，其含有以下成分：500mM Tris-HCl (pH8.0)、50mM MgCl₂、250mM KCl以及15v/v%的DMSO。

优选的，所述试剂盒还包含病毒核酸提取液A、病毒核酸提取液B；病毒提取液A每1000ml中含有：异硫氰酸胍480g，0.1M Tris-HCl（pH 6.4）500ml，0.2M EDTA（pH8.0）120ml；病毒提取液B为异丙醇。

一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

1）提取待测样品中的总RNA；

2）以得到的总RNA为模板，使用用于检测禽流感病毒H4亚型的引物和探针