[发明专利]水牛睾丸间质细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于将水牛睾丸组织通过胶原酶消化、不连续Percoll梯度离心和差速贴壁法在体外分离出水牛睾丸间质细胞。

2.根据权利要求1所述的水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)水牛睾丸除去白膜，取黄豆大小的组织并剪碎，用磷酸缓冲液PBS冲洗后加入消化液在摇床中震荡消化；

(2)将步骤(1)所得的混合物转移至50ml离心管中，加入等量DMEM/F12无血清细胞培养液终止反应，静置数分钟；

(3)将步骤(2)所得上层溶液用70μm细胞筛过滤悬液，将此细胞悬液离心，弃上清，用DMEM/F12无血清细胞培养液重复清洗两次，最后一次用37℃预热完全培养基清洗并制成单细胞悬液；

(4)将步骤(3)所得的单细胞悬液进行Percoll不连续密度梯度离心，然后将睾丸间质细胞条带吸出；

(5)将步骤(4)所得水牛睾丸间质细胞悬液用DMEM/F12无血清细胞培养液稀释成1×10⁶/mL，接种在6cm细胞培养皿里，接种4mL每皿，放入培养箱培养，条件为5％CO₂，95％O₂，37℃，最大饱和湿度，6h后，更换DMEM/F12无血清细胞培养液以取得纯度较高的间质细胞。

3.根据权利要求2所述的水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于步骤(1)中震荡消化37℃恒温、30min-40min、100r/min，所用消化液是按照体积比1:2加入2mL0.1％胶原酶IV和4mL DMEM/F12细胞培养液的混合液。

4.根据权利要求2所述的水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于步骤(3)中细胞悬液离心采用1300r/min，5min；所述完全培养基由DMEM培养基添加10％胎牛血清制成。

5.根据权利要求2所述的水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于步骤(4)中Percoll不连续密度梯度离心的条件为：Percoll密度梯度1.090g/ml、1.080g/ml、1.065g/ml、1.045g/ml，每个梯度加入2ml，高速低温冷冻离心机水平转子4℃，4000r/min，60min；所述睾丸间质细胞条带在1.080g/ml密度梯度处。