[发明专利]水牛睾丸间质细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种水牛睾丸间质细胞的分离培养方法。

背景技术

动物组织细胞体外培养，即将活体动物的某一组织结构从动物体内取出，然后把它放在与体内生长环境相类似的培养液中培养，使其继续生长和繁殖的一个过程，认为将其分为组织培养、器官培养、细胞培养等。其中，细胞培养强调的是，在体外培养的过程中只能是细胞形式而不能够形成组织，并且一般的细胞培养都是某种单一细胞的培养，这就要求操作人员首先要对目的细胞的形态、生长特点、特异性等有一定的了解。19世纪末，德国的动物学家Wilhelm Roux将鸡胚髓板组织在温热的生理盐水中放置数天，仍然可以存活下来。随后，分别在1887年、1897年、1903年又有学者在蛙、兔、蝾螈的组织上做了类似的实验，均使动物组织细胞在体外成功存活一段时间。组织细胞体外培养技术一经建立，便得到了飞速发展，如今，人们已经能够在体外成功培养出各种动物的多种细胞。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种精确、高效的水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，获得的水牛睾丸间质细胞纯度较高。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，将水牛睾丸组织通过胶原酶消化、不连续Percoll梯度离心和差速贴壁法在体外分离出水牛睾丸间质细胞。

上述水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

(1)水牛睾丸除去白膜，取黄豆大小的组织并剪碎，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗后加入消化液在摇床中震荡消化；

(2)将步骤(1)所得的混合物转移至50ml离心管中，加入等量DMEM/F12无血清细胞培养液终止反应，静置数分钟；

(3)将步骤(2)所得上层溶液用70μm细胞筛过滤悬液，将此细胞悬液离心，弃上清，用DMEM/F12无血清细胞培养液重复清洗两次，最后一次用37℃预热完全培养基清洗并制成单细胞悬液；

(4)将步骤(3)所得的单细胞悬液进行Percoll不连续密度梯度离心，然后将睾丸间质细胞条带吸出；

(5)将步骤(4)所得水牛睾丸间质细胞悬液用DMEM/F12无血清细胞培养液稀释成1×10⁶/mL，接种在6cm细胞培养皿里，接种4mL每皿，放入培养箱培养，条件为5％CO₂，95％O₂，37℃，最大饱和湿度，6h后，更换DMEM/F12无血清细胞培养液以取得纯度较高的间质细胞。

步骤(1)中震荡消化37℃恒温、30min-40min、100r/min，所用消化液是按照体积比1:2加入2mL0.1％胶原酶IV和4mL DMEM/F12细胞培养液(不含血清)的混合液。

步骤(3)中细胞悬液离心采用1300r/min，5min；所述完全培养基由DMEM培养基添加10％胎牛血清制成。

步骤(4)中Percoll不连续密度梯度离心的条件为：Percoll密度梯度1.090g/ml、1.080g/ml、1.065g/ml、1.045g/ml，每个梯度加入2ml，高速低温冷冻离心机水平转子4℃，4000r/min，60min；所述睾丸间质细胞条带在1.080g/ml密度梯度处。

由于水牛睾丸体积大、组织坚韧因而缺乏成熟有效的组织细胞分离培养方法，为此，发明人建立了一种水牛睾丸间质细胞的分离培养方法，将水牛睾丸组织通过胶原酶消化、不连续Percoll梯度离心和差速贴壁法，在体外成功分离出水牛睾丸间质细胞。3β-HSD染色表明，该法获得的水牛睾丸间质细胞纯度较高。本发明的方法精确、高效，是一套较适合水牛睾丸间质细胞体外分离培养的体系，可为水牛供体细胞核移植及相关研究提供材料来源和技术平台。

附图说明

图1是应用本发明获得的水牛睾丸间质细胞(刚分离出时)的显微镜观察图。

图2是应用本发明获得的水牛睾丸间质细胞(分离出后6小时)的显微镜观察图。

图3是应用本发明获得的水牛睾丸间质细胞(分离出后第3天)的显微镜观察图。

图4是应用本发明获得的水牛睾丸间质细胞(分离出后第96天)的显微镜观察图。

图5是应用本发明获得的水牛睾丸间质细胞3β-HSD染色后的显微镜观察图。

具体实施方式