[发明专利]一种埃博拉病毒快速分型鉴别检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种埃博拉病毒型别鉴定检测的试剂盒，特别是涉及一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术一管反应即可鉴别出埃博拉病毒四种致病性型别的试剂盒。本试剂盒主要包括RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H₂O，以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。由于本试剂盒能准确区分4种致病性型别的埃博拉病毒即：扎伊尔型埃博拉病毒、本迪布焦型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、塔伊森林型埃博拉病毒，可广泛应用于埃博拉病毒病临床早期诊断、重症病例预警、口岸检验检疫、疫情防控、媒介控制及科学研究等多个领域。

背景技术

埃博拉病毒病(EVD；以往称为埃博拉病毒性出血热)是严重的、往往致命的人类疾病。在1976年首次发生于刚果民主共和国(前扎伊尔)埃博拉河流域，因其引起病人全身性出血症状，故命名为埃博拉出血热。世界卫生组织(WHO)已经将其列为对人类危害最严重的传染病之一，并规定有关其活病毒的研究必须在生物安全4级实验室中进行。EVD的病原体是埃博拉病毒，主要通过体液、血液、分泌物进行传播。埃博拉病毒通过干扰感染者机体凝血平衡，导致血管壁破坏或功能受损，血小板不能凝血，在2-21天内出现出血性休克或器官衰竭，死亡率很高。

埃博拉病毒隶属于丝状病毒科(Filoviridae)，丝状病毒属(Filovirus)，是非分节段的单股负链RNA病毒。埃博拉病毒属包括五种不同的型别：本迪布焦埃博拉病毒(BDBV)、扎伊尔埃博拉病毒(EBOV)、雷斯顿埃博拉病毒(RESTV)、苏丹埃博拉病毒(SUDV)和塔伊森林埃博拉病毒(TAFV)。除雷斯顿埃博拉病毒对人呈隐形感染外，其余4亚型对人都有致死性。本迪布焦埃博拉病毒、扎伊尔埃博拉病毒和苏丹埃博拉病毒与非洲埃博拉病毒病大型疫情相关，而雷斯顿埃博拉病毒和塔伊森林埃博拉病毒则与之无关。

埃博拉病毒病病人样本具有极端生物危害风险；只有在最高级别的生物防护条件下才可进行检测。埃博拉病毒感染可通过若干类型的实验室检测获得明确诊断，如：抗体捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)、抗原检测试验、血清中和试验、常规RT-PCR检测、Real time RT-PCR检测、电子显微镜检查和病毒分离培养。但是，血清学试验、病毒培养具有灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺点；而常规RT-PCR又容易产生污染，造成假阳性的产生。多重实时荧光PCR技术是将PCR技术和多色荧光标记探针相结合的先进技术，该方法具有快速、特异、灵敏、自动化程度高等特点，结合防污染技术处理，特别适合于大规模、快速诊断的需求。该技术采用多色荧光对多条种特异性探针进行标记，配合多重PCR技术，可以在同一个PCR反应管中对多个病毒同时进行扩增，各色荧光的增长信号与相应PCR产物的增长量成等比关系，并被自动化荧光检测仪收集，最后可通过分析荧光增长曲线达到检测病原体类型的目的。由于，荧光PCR技术具有扩增片段短，引物、探针具有双重特异等优点，因此，将多重实时荧光PCR技术应用于埃博拉病毒分型的快速检测，能够节约时间、减少取材数量、提高检测鉴别效率，能在短时间内判断疑似病例或可疑媒介是否感染致病性埃博拉病毒及同时确诊所感染的型别，便于临床及时采取必要的防控和治疗措施，防止这些病毒继续传播，并提高诊疗效率，为快速诊断、有效监测和针对性治疗提供支持和依据。

本发明采用实时荧光PCR技术中的多重实时荧光PCR方法，对埃博拉病毒的四种致病性型别(本迪布焦型、扎伊尔型、苏丹型和塔伊森林型)核酸进行扩增，根据标记的四色荧光的扩增情况，来鉴别埃博拉病毒的致病性型别。本发明的试剂盒可广泛地运用于由埃博拉病毒引发的埃博拉出血热或疑似埃博拉出血热患者的样本检测和实验室诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术进行对四种致病性埃博拉病毒型别的鉴别试剂盒，利用本试剂盒可以准确区分本迪布焦埃博拉病毒、扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒和塔伊森林埃博拉病毒。

在对GENBANK上所有已知的埃博拉病毒各致病性型别的核酸序列进行比对的基础上，分别寻找各型别核酸序列的特异性保守区，并针对保守区设计靶核苷酸引物和探针。这些引物探针在含有耐热DNA聚合酶，逆转录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR反应酶系以及含有Mg²⁺等成份的RT-PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。